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主要作者与机构

该研究由Thomas Hix-Janssens、Julia R. Davies、Nicholas W. Turner、Börje Sellergren和Mark V. Sullivan共同完成。主要研究机构包括瑞典马尔默大学（Malmö University）的健康与社会学院生物医学科学系、牙科学学院口腔生物学与病理学系，以及英国谢菲尔德大学（University of Sheffield）化学系。该研究发表于期刊《Analytical and Bioanalytical Chemistry》，于2024年6月20日在线发表。

学术背景

研究领域为生物传感技术与分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymers, MIPs）的应用。牙周病（Periodontal Disease, PD）是一种影响牙齿支持结构（如牙槽骨和结缔组织）的口腔健康问题，是全球治疗成本最高的疾病之一。近年来，牙周病还与心血管疾病和阿尔茨海默病相关联。然而，目前缺乏准确的诊断工具来识别牙周病进展高风险人群。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, Pg）被认为是牙周病进展的主要致病因子之一，其产生的精氨酸特异性蛋白酶（Rgp）和赖氨酸特异性蛋白酶（Kgp）在疾病进展中起重要作用。因此，开发高灵敏度、高选择性的检测方法对牙周病的早期诊断和治疗具有重要意义。

本研究旨在开发一种基于分子印迹纳米凝胶（Molecularly Imprinted Nanogels, MINs）的超灵敏生物传感器，用于检测牙周病生物标志物（Rgp和Kgp）。通过将Rgp和Kgp的短表位序列固定在磁性纳米颗粒平台上，制备高亲和力、高选择性的分子印迹纳米凝胶，并利用表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术进行表征。

研究流程

研究主要包括以下步骤：

1. 磁性纳米颗粒的制备

采用微波辅助的溶剂热法合成磁性纳米颗粒（Magnetic Nanoparticles, MNPs）。以六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）为铁源，乙酸钠（NaOAc）为还原剂，乙二醇为溶剂，通过微波加热至200°C，反应20分钟。合成的纳米颗粒经过多次洗涤和干燥后，使用氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS）进行表面修饰，引入氨基基团。

2. 表位肽的固定

将Rgp和Kgp的表位肽通过硫醇-烯点击化学（Thiol-Ene Click Chemistry）固定在磁性纳米颗粒表面。具体步骤包括：将氨基修饰的磁性纳米颗粒与磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（Sulfo-SMCC）反应，引入马来酰亚胺基团；随后，将表位肽通过其末端的半胱氨酸残基与马来酰亚胺基团偶联，完成肽的固定。

3. 分子印迹纳米凝胶的合成

以N-叔丁基丙烯酰胺（TBAM）、N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐（APMA）为单体，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）为交联剂，通过自由基聚合反应在磁性纳米颗粒表面合成分子印迹纳米凝胶。聚合反应在40°C下进行，持续过夜。反应完成后，通过磁性分离获得高亲和力的纳米凝胶，并通过洗脱步骤去除未反应的物质。

4. 纳米凝胶的表征

使用动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）测定纳米凝胶的流体动力学直径，并通过表面等离子体共振（SPR）技术评估其与目标肽的结合亲和力。SPR实验中，将纳米凝胶固定在羧甲基葡聚糖修饰的金芯片表面，通过EDC/NHS偶联化学实现共价结合。随后，使用不同浓度的目标肽进行结合实验，记录SPR信号变化。

5. 数据分析

通过SPR传感器图谱计算纳米凝胶与目标肽的结合动力学参数（如结合常数Ka和解离常数Kd），并绘制校准曲线，推算出理论检测限（Limit of Detection, LoD）。此外，还通过细菌培养上清液（包括Rgp敲除株E8、Kgp敲除株K1A和野生型W50-D）验证纳米凝胶在复杂基质中的选择性。

主要结果

1. 磁性纳米颗粒的合成与表征：通过微波辅助法成功合成了直径40-50 nm的球形磁性纳米颗粒，X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了其晶体结构和表面修饰。
2. 分子印迹纳米凝胶的合成与表征：合成的Rgp和Kgp纳米凝胶的流体动力学直径分别为183±1 nm和137±20 nm，且表现出较高的单分散性。SPR实验显示，Rgp和Kgp纳米凝胶与目标肽的结合常数分别为79.4 nM和89.7 nM，理论检测限分别为1.27 nM和2.00 nM。
3. 复杂基质中的选择性验证：纳米凝胶在脑心浸液（BHI）培养基中表现出对目标蛋白的高选择性，能够有效区分Rgp和Kgp，且对野生型W50-D菌株的检测限分别为3.5 nM和3.7 nM。

结论

本研究成功开发了一种基于分子印迹纳米凝胶的超灵敏生物传感器，能够高效检测牙周病生物标志物Rgp和Kgp。该方法具有高亲和力、高选择性和低检测限，且在复杂基质中表现出良好的适用性。该研究为牙周病的早期诊断提供了新的技术手段，并展示了分子印迹聚合物在生物传感领域的广泛应用潜力。

研究亮点

1. 创新性方法：首次将微波辅助合成法与分子印迹技术结合，用于制备高灵敏度的纳米凝胶生物传感器。
2. 高灵敏度与选择性：纳米凝胶对目标肽的结合常数在纳摩尔级别，且能够有效区分复杂基质中的目标蛋白。
3. 应用价值：该方法为牙周病的早期诊断提供了新的工具，并有望推广至其他疾病的生物标志物检测。

其他有价值的内容

研究还探讨了纳米凝胶在电化学平台和多重检测系统中的应用潜力，为未来开发多功能生物传感器提供了思路。此外，研究团队对纳米凝胶的合成工艺进行了优化，显著提高了纳米颗粒的产率和稳定性。