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作者与机构
本研究的主要作者包括Longwei Liu、Peixiang He、Yuxuan Wang等，研究团队来自美国南加州大学（University of Southern California）、加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）、耶鲁大学（Yale University）等多家知名机构。该研究于2025年5月15日发表在期刊《Cell》上，题为“Engineering Sonogenetic Echoback-CAR T Cells”。
学术背景
本研究属于免疫治疗和合成生物学领域，聚焦于CAR-T细胞（Chimeric Antigen Receptor T Cells，嵌合抗原受体T细胞）疗法在实体瘤治疗中的应用。尽管CAR-T细胞疗法在血液肿瘤治疗中取得了显著成功，但在实体瘤治疗中仍面临诸多挑战，包括脱靶毒性（on-target off-tumor toxicity）、T细胞耗竭（exhaustion）以及T细胞持久性不足等问题。为了解决这些问题，研究团队开发了一种新型的声遗传学（sonogenetic）CAR-T细胞——Echoback-CAR T细胞，通过超声（focused ultrasound, FUS）远程控制CAR表达，从而在实现高效肿瘤杀伤的同时减少毒性。
研究流程
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热休克启动子（heat-shock promoter）的优化
研究团队首先通过高通量筛选技术（sort-seq）对热休克启动子进行了优化。他们构建了一个包含16,384种不同热休克元件（heat-shock element, HSE）变体的文库，并在Jurkat T细胞中进行筛选。通过多轮荧光激活细胞分选（FACS）和下一代测序（NGS），研究人员筛选出诱导效率最高且泄漏表达最低的启动子变体（如克隆#4）。进一步实验表明，该优化启动子在短时热休克刺激下能够显著提高CAR表达。
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正反馈回路（positive feedback loop）的设计
为了提高CAR表达的持久性，研究团队设计了一种正反馈回路，将CAR信号通路（如NF-κB、NFAT、cAMP等）与CAR表达调控相结合。通过引入NF-κB响应元件、NFAT响应元件和cAMP响应元件，研究人员构建了多种反馈设计，最终发现反馈设计#4能够在肿瘤细胞共培养条件下维持CAR表达长达3天，显著优于传统设计。
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Echoback-CAR T细胞的构建与验证
研究团队将优化后的热休克启动子与正反馈回路整合，构建了Echoback-CAR T细胞。在体外实验中，这些细胞在超声刺激下表现出强大的肿瘤杀伤能力，且毒性较低。此外，研究人员还通过3D肿瘤球体模型验证了Echoback-CAR T细胞的治疗效果，发现其在两次热休克刺激后几乎完全消除了肿瘤体积。
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体内实验
在小鼠模型中，研究团队验证了Echoback-CAR T细胞对胶质母细胞瘤（glioblastoma）和前列腺癌的治疗效果。结果显示，Echoback-CAR T细胞能够显著抑制肿瘤生长，并延长小鼠的生存期，且未观察到明显的脱靶毒性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）进一步表明，Echoback-CAR T细胞具有更强的细胞毒性，且T细胞耗竭程度较低。
主要结果
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热休克启动子的优化
通过sort-seq筛选，研究团队获得了诱导效率显著提高的热休克启动子变体（如克隆#4）。在短时热休克刺激下，该启动子驱动的CAR表达量比传统启动子高出4.32倍至5.88倍。
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正反馈回路的设计
反馈设计#4在肿瘤细胞共培养条件下能够维持CAR表达长达3天，显著优于传统设计。这一结果通过流式细胞术和荧光显微镜成像得到了验证。
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Echoback-CAR T细胞的肿瘤杀伤能力
在体外和体内实验中，Echoback-CAR T细胞在超声刺激下表现出强大的肿瘤杀伤能力。在3D肿瘤球体模型中，两次热休克刺激后肿瘤体积几乎完全消除。在小鼠模型中，Echoback-CAR T细胞显著抑制了胶质母细胞瘤和前列腺癌的生长，并延长了小鼠的生存期。
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单细胞RNA测序分析
scRNA-seq结果显示，Echoback-CAR T细胞具有更高的细胞毒性评分和较低的耗竭评分，表明其在长期肿瘤刺激下仍能保持高效的功能。
结论与意义
本研究开发了一种新型的Echoback-CAR T细胞，通过超声远程控制CAR表达，实现了对实体瘤的高效治疗，同时显著减少了脱靶毒性和T细胞耗竭。这一技术不仅为CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中的应用提供了新的解决方案，还为合成生物学和免疫治疗的结合开辟了新的研究方向。此外，研究团队开发的sort-seq平台和正反馈回路设计为未来优化其他可调控基因表达系统提供了重要的技术参考。
研究亮点
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通过sort-seq技术优化了热休克启动子，显著提高了CAR表达的诱导效率和特异性。
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设计了正反馈回路，将CAR信号通路与CAR表达调控相结合，显著延长了CAR表达的持久性。
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构建了Echoback-CAR T细胞，在体外和体内实验中表现出强大的肿瘤杀伤能力和低毒性。
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通过单细胞RNA测序揭示了Echoback-CAR T细胞在长期肿瘤刺激下的功能特性。
其他有价值的内容
研究团队还验证了Echoback-CAR T细胞在前列腺癌治疗中的效果，展示了该技术的广泛适用性。此外，研究提出的双侧肿瘤模型为评估CAR-T细胞的脱靶毒性提供了新的实验方法。
以上报告详细介绍了该研究的背景、流程、结果及其科学和应用价值，为读者提供了全面的理解。