这篇文档属于类型a，即报告了一项原创性研究。以下是对该研究的学术报告：

主要作者及研究机构

本研究由Myeonghwan Kim、Youngjoon Pyo、Seong-in Hyun、Minseok Jeong、Yeon Choi和V. Narry Kim等人共同完成。研究团队来自韩国首尔大学（Seoul National University）的基础科学研究院（Institute for Basic Science）和生物科学学院（School of Biological Sciences）。研究结果于2025年发表在《Science》期刊上，DOI为10.1126/science.ads4539。

学术背景

该研究属于分子生物学领域，聚焦于外源性RNA（exogenous RNA）的细胞内调控机制。外源性RNA，包括治疗性mRNA和病毒RNA，必须克服细胞屏障和防御机制才能进入细胞并合成蛋白质。目前，临床mRNA技术使用离子化脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）来递送体外转录（in vitro–transcribed, IVT）的mRNA，这些mRNA通常带有5'帽结构、poly(A)尾和N1-甲基假尿苷（m1Ψ）修饰，以提高蛋白质产量。尽管LNP-mRNA技术应用广泛，但其调控机制尚不明确。研究团队旨在通过系统性筛选，揭示外源性RNA生命周期中的关键调控因子，以推动mRNA治疗技术的发展。

研究流程

研究分为以下几个主要步骤：

1. 基因组CRISPR-Cas9筛选

   研究团队使用全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，以鉴定调控外源性mRNA的细胞因子。HCT116细胞被转导了单导向RNA（single guide RNA, sgRNA）文库，随后转染了编码增强绿色荧光蛋白（EGFP）的mRNA。IVT mRNA被合成，部分带有m1Ψ修饰，以确定该修饰如何增强蛋白质输出。此外，研究团队还使用稳定表达EGFP的细胞系进行对照筛选，以区分内源性和外源性mRNA的调控因子。通过荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）分离出荧光最低和最高的细胞，并对富集的sgRNA进行测序，以鉴定正负调控因子。

2. 筛选结果分析

   从筛选中，研究团队发现了多个正调控因子，包括参与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan, HSPG）合成、囊泡运输和液泡ATP酶（vacuolar ATPase, V-ATPase）亚基的基因。HSPG是细胞表面糖蛋白，能够促进mRNA的内化。V-ATPase是质子泵，能够酸化内体，促进LNP-mRNA的内体逃逸。此外，研究团队还鉴定出TRIM25——一种RNA结合E3泛素连接酶——作为关键的细胞质抑制因子。TRIM25的敲除或敲低能够显著提高LNP-mRNA的基因表达。

3. TRIM25的功能验证

   研究团队进一步验证了TRIM25的功能，发现其通过诱导RNA降解来抑制外源性RNA，而不显著影响翻译或去腺苷化。TRIM25还能够下调环状RNA和线性RNA，表明其可能通过内切核糖核酸酶机制发挥作用。研究团队还鉴定出两种内切核糖核酸酶N4BP1和KHNYN，以及锌指抗病毒蛋白（ZAP），它们在TRIM25依赖的RNA降解中发挥冗余作用。m1Ψ修饰能够降低TRIM25的RNA结合和泛素化活性，帮助RNA逃逸其抑制作用。

4. TRIM25的激活机制

   研究团队发现，TRIM25的RNA结合亲和力在酸性pH条件下显著增加，表明其可能通过内体破裂释放的质子激活。这一发现表明，TRIM25能够选择性识别通过内体途径进入细胞质的外源性RNA，并在局部pH下降时被激活。

主要结果

1. HSPG和V-ATPase的作用

   研究证实，HSPG在LNP-mRNA的细胞摄取中起关键作用，而V-ATPase则通过酸化内体促进mRNA的内体逃逸。这些结果表明，HSPG和V-ATPase是LNP-mRNA递送的关键调控因子。

2. TRIM25的RNA降解机制

   TRIM25通过诱导RNA降解来抑制外源性RNA，而不显著影响翻译或去腺苷化。研究团队还发现，TRIM25的RNA结合亲和力在酸性pH条件下显著增加，表明其可能通过内体破裂释放的质子激活。

3. m1Ψ修饰的作用

   m1Ψ修饰能够降低TRIM25的RNA结合和泛素化活性，帮助RNA逃逸其抑制作用。这一发现解释了为什么m1Ψ修饰能够有效提高IVT mRNA的蛋白质输出。

结论

本研究揭示了LNP-mRNA递送和稳定性的细胞调控机制，鉴定了HSPG、V-ATPase和TRIM25作为关键调控因子。研究结果表明，TRIM25能够通过局部pH变化选择性识别外源性RNA，并在内体破裂时被激活。这一发现不仅为RNA免疫和治疗提供了新的见解，还为改进mRNA治疗技术提供了理论依据。

研究亮点

1. 重要发现

   本研究首次系统性地鉴定了调控外源性RNA的关键细胞因子，揭示了TRIM25在RNA降解中的核心作用。

2. 方法创新

   研究团队使用全基因组CRISPR-Cas9筛选和FACS技术，结合多种分子生物学实验，系统地揭示了外源性RNA的细胞内调控机制。

3. 应用价值

   研究结果为改进mRNA治疗技术提供了理论依据，特别是通过m1Ψ修饰和调控TRIM25活性来提高mRNA的稳定性和蛋白质输出。

其他有价值的内容

研究团队还发现，TRIM25的RNA结合亲和力在酸性pH条件下显著增加，表明其可能通过内体破裂释放的质子激活。这一发现为理解细胞内pH变化在RNA免疫中的作用提供了新的视角。