蓝莓花青素与乳清蛋白分离物的稳定性及抗氧化性能研究综述
研究背景
蓝莓因富含花青素（Anthocyanins, ANs）而备受欢迎，其具有高抗氧化性和多种生物功能，例如抗癌和抗炎活性，因此在食品工业中广泛应用。然而，花青素在酸性条件（pH < 3）下最为稳定，但在碱性条件、高温、强光及氧气存在下容易降解，这显著限制了其在食品加工和储存中的应用。提高花青素的稳定性，延长其营养价值和功能性是一项重要课题。
近年来，研究发现蛋白质作为生物大分子，能够通过化学相互作用提高花青素的稳定性。例如，大豆蛋白和牛血清蛋白均显示了保护花青素的潜力，而乳清蛋白分离物（Whey Protein Isolate, WPI）以其丰富的必需氨基酸及高营养价值备受关注。本研究以蓝莓花青素中的主要单体物质——矢车菊素-3-O-半乳糖苷（Malvidin-3-O-galactoside, M3G）为研究对象，通过体外模拟消化及多种光谱和分子对接技术，探讨WPI与花青素的相互作用机制及其对花青素稳定性和抗氧化能力的影响。
研究目的
本研究旨在： 1. 探索WPI与蓝莓花青素（ANs）的结合机制； 2. 研究WPI对花青素在加工、储存及体外模拟消化过程中的保护作用； 3. 为开发功能性乳制品及其在食品领域中的应用提供理论基础。
研究方法
1. 材料与实验设计
- 材料来源：乳清蛋白分离物（90%纯度）和蓝莓花青素购自国内专业公司；主要实验试剂包括VC（维生素C）、蔗糖、消化酶等。
- 花青素与WPI的处理：花青素与不同浓度WPI混合后，分别置于光照、氧化环境以及模拟的消化液中测试其稳定性和抗氧化性能。
2. 花青素稳定性测试
- 光照稳定性：样品在UV灯箱中暴露7天，每隔数天检测花青素的残留率。
- 氧化稳定性：在添加VC或蔗糖的条件下，测定不同浓度WPI对花青素氧化降解的抑制作用。
- 模拟消化稳定性：模拟从口腔到小肠的消化环境，分别收集不同阶段的样品测定花青素的残留量。
3. 多种光谱和分子对接分析
- 荧光光谱与同步荧光分析：研究WPI与M3G的结合机制及荧光猝灭特性，计算结合常数、猝灭常数及结合位点。
- 圆二色谱与红外光谱：探讨WPI与M3G相互作用后WPI的二级结构变化。
- 分子对接：模拟WPI主要成分（β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白及免疫球蛋白）与M3G的结合位点和结合模式。
4. 抗氧化能力测试
采用PSC法（过氧自由基清除能力）测定不同实验条件下花青素的抗氧化能力。
研究结果与讨论
1. WPI对花青素稳定性的保护作用
- 光照稳定性：在7天光照实验中，添加0.15 mg/mL WPI的样品花青素保留率高达65.42%，显著高于无蛋白组。荧光光谱显示，这主要归因于WPI与花青素的非共价结合，减少了环境对花青素的破坏。
- 氧化稳定性：VC和蔗糖加速了花青素的降解，但添加0.15 mg/mL WPI的样品保留率分别达到59.84%和75.36%，表明WPI对氧化降解具有显著的抑制作用。
- 模拟消化稳定性：体外消化实验表明，小肠阶段花青素的保留率由未加蛋白组的6.03%提高至7.59%，WPI在胃酸及肠液环境中为花青素提供了一定保护。
2. WPI对花青素抗氧化能力的增强
- 添加0.15 mg/mL WPI的样品抗氧化能力显著提高，VC环境下其抗氧化值为4.56 mg VC-equiv/mg ANs，而未添加蛋白的花青素抗氧化值仅为2.01 mg VC-equiv/mg ANs。说明WPI在保护花青素抗氧化性能方面具有重要作用。
3. WPI与M3G的结合机制
- 荧光猝灭分析表明WPI与M3G之间为静态猝灭机制，结合常数随温度升高而下降，表明结合稳定性逐渐降低。
- 热力学分析显示两者间主要以疏水作用为驱动力，少量为氢键结合。
- 分子对接分析揭示M3G的羟基与WPI成分（特别是免疫球蛋白）的特定氨基酸通过疏水作用及氢键相互作用，其中免疫球蛋白的结合能最低（-141.30 kcal/mol），对花青素的稳定性和抗氧化性贡献最大。
4. WPI对二级结构的影响
- 圆二色谱和红外光谱结果显示，与M3G结合后WPI的α螺旋结构减少，β折叠和无规卷曲结构增多，表明其蛋白质结构发生了显著变化。
研究结论
本研究通过多种实验方法系统探讨了乳清蛋白分离物对蓝莓花青素稳定性和抗氧化性能的保护机制，主要结论如下： 1. WPI能够通过非共价结合显著提高蓝莓花青素的稳定性，在光照、氧化及模拟消化等多种条件下均表现出显著的保护作用； 2. WPI增强了花青素的抗氧化能力，特别是在添加VC的条件下； 3. 分子机制研究表明，WPI通过疏水作用及氢键与花青素结合，其中免疫球蛋白贡献最大。
本研究为开发含花青素的功能性乳制品提供了科学依据，也为蓝莓花青素的应用拓展提供了理论支持。未来可以进一步优化WPI与花青素的结合条件，提升其工业应用价值。