本研究的主要作者包括Jie Liu、Ying Ou、Jian-Zhong Xu、Zhi-Ming Rao和Wei-Guo Zhang。研究由江南大学工业生物技术教育部重点实验室和国家粮食发酵技术工程实验室完成。该研究于2023年8月19日在线发表在《Bioresource Technology》期刊上，文章编号为129701。
L-赖氨酸（L-lysine）是一种重要的氨基酸，广泛应用于食品加工、医药制剂和饲料添加剂等领域。Corynebacterium glutamicum（谷氨酸棒状杆菌）作为一种GRAS（Generally Recognized As Safe）微生物，具有良好的鲁棒性，是L-赖氨酸大规模生产的重要底盘细胞。然而，传统的物理或化学诱变方法存在安全性问题，且后续筛选工作量大。此外，代谢途径的高度复杂性和相互关联性使得单个基因的过表达或敲除往往导致不可预测的表型。
近年来，系统代谢工程（systems metabolic engineering）成为打破这些障碍的有力工具，它能够同时修改多个控制基因的设计，以高效生产各种代谢产物。本研究旨在通过系统代谢工程技术，构建高效生产L-赖氨酸的C. glutamicum菌株，并通过动态调控NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）池来优化细胞内环境，从而提高L-赖氨酸的产量。
本研究的主要流程包括以下几个步骤：
通过对先前研究中获得的L-赖氨酸高产突变体进行全基因组测序，鉴定了与L-赖氨酸合成相关的关键染色体突变。研究发现，突变体Lys-1的基因组中有1390个单核苷酸变异（SNVs）和70个插入/缺失（indels）。通过基因功能富集分析，发现与催化活性和代谢过程相关的基因功能项占比最高，这些突变可能涉及L-赖氨酸产量增加的机制。
通过删除磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEP carboxykinase）基因pck，并过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEP carboxylase）和丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase）基因，成功将碳流重定向至L-赖氨酸合成途径。此外，通过替换六个关键酶基因的天然启动子为强启动子ptrc，进一步提高了L-赖氨酸的产量。
通过替换磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase）基因的天然启动子为强启动子ptrc，并敲除AMP核苷酸酶（AMP nucleotidase）基因amn，显著提高了细胞内ATP水平，从而促进了L-赖氨酸的合成。
通过敲除L-赖氨酸转运蛋白基因lysp，并过表达内源性L-赖氨酸输出蛋白基因lyse和外源性L-赖氨酸输出蛋白基因ybje，有效防止了L-赖氨酸的反馈抑制，进一步提高了L-赖氨酸的产量。
通过半理性设计和高通量筛选，获得了对细胞内L-赖氨酸浓度敏感的突变体LysG（E123Y, E125A），并构建了一个L-赖氨酸响应启动子库。该启动子库能够动态调控NADPH池，从而优化细胞内环境。
通过选择不同强度的L-赖氨酸响应启动子，动态调控非磷酸化NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapn）的表达，实现了细胞内NADPH池的实时优化。实验结果表明，基于gapn的NADPH再生策略能够有效提高L-赖氨酸的合成。
在5L生物反应器中进行分批补料发酵实验，最终工程菌株Lys-6的L-赖氨酸产量达到223.4 ± 6.5 g/L，比初始菌株Lys-1提高了72.9%。
本研究通过系统代谢工程技术，成功构建了高效生产L-赖氨酸的C. glutamicum菌株。通过基因组分析、碳流重编程、ATP供应增强、产物运输系统改进以及动态调控NADPH池，最终工程菌株在5L生物反应器中的L-赖氨酸产量达到223.4 g/L，糖酸转化率为0.68 g/g葡萄糖。
本研究首次通过增强ATP供应和NADPH自调控来改善细胞内环境，从而显著提高了L-赖氨酸的产量。系统代谢工程结合动态调控技术，为构建高效微生物细胞工厂以生产高价值产物提供了新的思路和方法。该研究不仅具有重要的科学价值，还为L-赖氨酸的工业化生产提供了可行的技术方案。
本研究还提供了详细的基因组分析数据、启动子库构建方法以及动态调控NADPH池的实验流程，为相关领域的研究人员提供了宝贵的参考。