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作者与期刊信息
这篇研究由Estefanía Contreras、Lucía Martín-Fernández、Arafet Manaa、Jesús Vicente-Carbajosa和Raquel Iglesias-Fernández共同完成，主要作者来自西班牙马德里理工大学（UPM）的生物技术和植物基因组中心（CBGP, UPM-INIA/CSIC）以及突尼斯的Borj Cedria生物技术中心。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》（IJMS），出版时间为2023年11月1日。
学术背景
藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）属于苋科（Amaranthaceae），是一种四倍体一年生植物，原产于南美洲。藜麦因其对多种环境胁迫（如盐胁迫、干旱和寒冷）的显著适应性而备受关注。近年来，随着全球气候变化的影响加剧，藜麦作为一种耐逆性强且营养价值高的作物，其种植面积在全球范围内迅速扩展。然而，在种子萌发阶段，藜麦种子在面对生物和非生物胁迫时表现出一定的脆弱性。为了深入研究藜麦种子萌发过程中的分子机制，本研究旨在筛选适合在盐胁迫条件下进行qPCR数据标准化的内参基因（reference genes）。这一步骤对于精确分析基因表达至关重要，因为传统内参基因在种子萌发过程中可能表现出不稳定性。
研究流程
本研究分为多个步骤，具体如下：
实验材料与处理
研究对象为两种藜麦种质（UDEC2和UDEC4），分别具有不同的耐盐性。种子经过表面消毒后，在含有不同浓度NaCl（0 mM、150 mM和250 mM）的Murashige和Skoog培养基（MS/2）上进行萌发实验。种子的萌发情况通过显微镜观察，并记录萌发时间（T50）和最大萌发率（MG%）。
候选内参基因的选择与验证
根据文献综述，研究选择了6个候选内参基因，包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、单宁敏感性1（MON1）、多嘧啶束结合蛋白（PTB）、肌动蛋白-7（ACT7）、泛素结合酶（UBC）和18S核糖体RNA（18S）。这些基因在其他植物物种的种子萌发研究中已被广泛使用。
RNA提取与qPCR实验
在不同时间点（0 h、12 h、24 h、48 h、72 h和120 h）收集种子样本，提取总RNA并合成cDNA。随后，使用qPCR技术检测候选内参基因的表达水平。每个样本设置三个生物学重复和技术重复。
数据分析
使用RefFinder工具整合四种算法（geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCT方法）评估候选内参基因的稳定性。此外，通过归一化目标基因（如CqMAN7和CqABI5）的表达数据，进一步验证了候选内参基因的适用性。
主要结果
1. 种子萌发特性
在250 mM NaCl条件下，UDEC2和UDEC4种子的萌发速度显著减慢（T50分别为85.5 ± 5.0 h和57.0 ± 3.9 h），而对照组（0 mM NaCl）的T50分别为21.1 ± 0.2 h和20.7 ± 0.8 h。此外，UDEC4在所有条件下均达到100%萌发率，而UDEC2在250 mM NaCl条件下的萌发率仅为73%。
内参基因稳定性分析
结果显示，CqACT7和CqUBC在种子萌发过程中表现出最高的稳定性，无论是在对照组还是盐胁迫条件下。相比之下，CqGAPDH、CqMON1和CqPTB的表达水平波动较大，不适合作为内参基因。
目标基因验证
通过归一化CqMAN7和CqABI5的表达数据，研究发现使用CqACT7和CqUBC作为内参基因时，目标基因的表达模式与预期模拟模式高度一致。例如，CqMAN7的表达量随着萌发进程逐渐增加，并在最大萌发率时达到峰值。
结论与意义
本研究成功鉴定了CqACT7和CqUBC作为藜麦种子萌发过程中在盐胁迫条件下的最佳内参基因。这一成果为未来研究藜麦种子萌发的分子机制提供了重要的工具。此外，研究还揭示了CqMAN7和CqABI5在种子萌发和盐胁迫响应中的潜在功能，为进一步探索藜麦的耐逆性机制奠定了基础。
研究亮点
1. 首次系统筛选了藜麦种子萌发过程中的内参基因，填补了该领域的空白。
2. 提出了CqACT7和CqUBC作为稳定内参基因的推荐，为相关研究提供了可靠的标准。
3. 通过目标基因验证，展示了所选内参基因在实际应用中的有效性。
其他有价值内容
研究还探讨了种子老化对萌发行为的影响，指出两年种子的萌发速度显著慢于一年种子。这一发现强调了种子储存条件的重要性，为藜麦种质资源的保存提供了参考依据。