Isolement et identification de trois nouvelles impuretés isomères dans la substance médicamenteuse de la milbémycine oxime

Contexte académique

Les milbémycines (Milbemycins) sont une classe de composés macrocycliques à 16 membres produits par les streptomyces (Streptomyces), possédant une puissante activité antiparasitaire et insecticide, tout en présentant une faible toxicité pour les mammifères. Les milbémycines et leurs dérivés sont largement utilisés dans les domaines agricole et vétérinaire pour contrôler divers insectes et parasites. La milbémycine oxime (Milbemycin Oxime, MO) est un produit semi-synthétique préparé par oxydation et oximation des milbémycines A3 et A4. Depuis sa première mise sur le marché en 1990, elle est principalement utilisée pour prévenir la dirofilariose chez les chiens et contrôler d’autres endoparasites.

Cependant, en tant que produit semi-synthétique dérivé de composés naturels, la MO forme inévitablement des impuretés lors du processus de synthèse, y compris des matières premières résiduelles, des intermédiaires, des produits de dégradation et des sous-produits. Ces impuretés peuvent affecter la qualité et la sécurité du médicament. Bien que la pharmacopée européenne et la pharmacopée américaine aient établi des normes pour les impuretés connues dans la MO, certaines impuretés inconnues restent non identifiées. Par conséquent, l’équipe de recherche vise à isoler et identifier les impuretés inconnues dans la MO afin d’optimiser les normes de contrôle de la qualité des médicaments.

Source de l’article

Cet article a été rédigé conjointement par Xiaohan Ren, Jianwei Lu, Yefei Wu, Shaoyong Zhang, Huan Qi, Hui Zhang, Jidong Wang et Linghui Zheng. Les auteurs sont affiliés respectivement à l’Université de Huzhou, à la Zhejiang Qianjiang Biochemical Co., Ltd, au Taizhou Vocational College of Science and Technology et à la Zhejiang Huida Biotech Co., Ltd. L’article a été publié en ligne le 28 novembre 2024 dans la revue The Journal of Antibiotics, avec le DOI 10.1038/s41429-024-00791-7.

Processus et résultats de la recherche

1. Détection et isolement des impuretés

L’équipe de recherche a d’abord analysé des échantillons de MO préparés en laboratoire ainsi que deux médicaments commerciaux de MO (Milpro® et Hailechong®) en utilisant la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC-MS). Deux pics d’impuretés inconnus ont été détectés, avec une masse moléculaire supérieure de 14 daltons à celle de la MO A4. Selon les directives de l’International Council for Harmonisation (ICH), la teneur de ces impuretés se situe entre 0,10 % et 0,15 %, dépassant le seuil d’identification de 0,10 %, nécessitant ainsi une identification approfondie.

Pour isoler ces impuretés, l’équipe a développé une méthode de préparation bidimensionnelle (2D). Tout d’abord, une colonne de préparation Agilent Zorbax-C3 a été utilisée pour la première dimension, avec une élution isocratique (eau/méthanol/acétonitrile = 30/35/35, v/v/v) à un débit de 1,5 mL/min. Ensuite, une colonne de préparation Sepax Amethyst C18-H a été utilisée pour la deuxième dimension, avec une élution isocratique (eau/méthanol = ¹⁵⁄₈₅, v/v) à un débit de 1,5 mL/min. Grâce à cette méthode, trois impuretés ont été isolées avec succès, nommées respectivement impureté 1, impureté 2 et impureté 3.

2. Identification structurelle des impuretés

Pour déterminer la structure de ces trois impuretés, l’équipe a utilisé la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et la résonance magnétique nucléaire (RMN). Les étapes spécifiques sont les suivantes :

• Impureté 1 : L’analyse par RMN 1H et 13C a révélé que l’impureté 1 partageait la même structure squelettique que la MO A4, mais qu’un groupe méthyle en position C-14 était remplacé par un groupe éthyle. Une analyse plus approfondie par spectroscopie COSY 1H-1H et HMBC a confirmé cette structure. Finalement, l’impureté 1 a été identifiée comme étant la 14-déméthyl-14-éthyl-MO A4.

• Impureté 2 : Une analyse RMN similaire a montré que l’impureté 2 était structurellement proche de la MO A4, mais qu’un groupe méthyle en position C-24 était remplacé par un groupe éthyle. Ainsi, l’impureté 2 a été identifiée comme étant la 24-déméthyl-24-éthyl-MO A4.

• Impureté 3 : L’analyse RMN a révélé que l’impureté 3 partageait une structure similaire à celle de la MO A4, mais qu’un groupe méthyle en position C-12 était remplacé par un groupe éthyle. Par conséquent, l’impureté 3 a été identifiée comme étant la 12-déméthyl-12-éthyl-MO A4.

3. Analyse de l’origine des impuretés

L’équipe a également analysé l’origine de ces impuretés. En comparant les structures des homologues naturels de la milbémycine, il a été constaté que ces impuretés pourraient provenir de l’oxydation et de l’oximation des homologues naturels de la milbémycine présents dans le bouillon de fermentation. Cette découverte fournit une base théorique importante pour le contrôle de la qualité de la MO.

Conclusion et signification de l’étude

Cette étude a permis d’isoler et d’identifier avec succès trois nouvelles impuretés isomères dans la MO, à savoir la 14-déméthyl-14-éthyl-MO A4, la 24-déméthyl-24-éthyl-MO A4 et la 12-déméthyl-12-éthyl-MO A4. L’identification de ces impuretés comble une lacune dans le contrôle de la qualité de la MO et fournit une référence importante pour le contrôle des impuretés lors de la production de médicaments.

En outre, la méthode de préparation bidimensionnelle développée par l’équipe a considérablement amélioré l’efficacité de la séparation des impuretés, offrant une nouvelle approche technique pour l’isolement d’impuretés de haute pureté dans des échantillons complexes. Cette méthode est non seulement applicable au contrôle de la qualité de la MO, mais peut également être étendue à la séparation et à l’identification d’impuretés dans d’autres médicaments complexes.

Points forts de l’étude

1. Identification de nouvelles impuretés : Première isolation et identification de trois nouvelles impuretés isomères dans la MO, comblant une lacune dans le contrôle de la qualité des médicaments.
2. Méthode de préparation bidimensionnelle : Développement d’une méthode de préparation bidimensionnelle efficace, améliorant significativement l’efficacité de la séparation des impuretés dans des échantillons complexes.
3. Analyse de l’origine des impuretés : En comparant les structures des homologues naturels de la milbémycine, l’étude a révélé le mécanisme de formation de ces impuretés, fournissant une base théorique pour le contrôle des impuretés lors de la production de médicaments.

Autres informations utiles

Cette étude a été financée par le fonds de la Fondation des sciences naturelles du Zhejiang (LGN22B020002), le projet de recherche publique de Huzhou (2021GZ25) et le projet de plan scientifique et technologique de Taizhou (24NYB10). L’équipe de recherche remercie également la Zhejiang Huida Biotech Co., Ltd et la Zhejiang Qianjiang Biochemical Co., Ltd pour leur soutien.

Grâce à cette recherche, les normes de contrôle de la qualité de la MO ont été améliorées, contribuant à renforcer la sécurité et l’efficacité des médicaments. À l’avenir, l’équipe prévoit d’optimiser davantage la méthode de préparation bidimensionnelle et de l’appliquer à la séparation et à l’identification d’impuretés dans d’autres médicaments complexes.