Étude sur l’ossification endochondrale médiée par Cav3.3 dans un hydrogel GelMA imprimé en 3D

Contexte de la recherche

Le développement osseux est un processus complexe dans lequel la plaque de croissance (Growth Plate, GP) joue un rôle crucial dans la croissance longitudinale des os longs. La plaque de croissance régule la maturation osseuse via le processus d’ossification endochondrale (Endochondral Ossification, EO). Cependant, les dysfonctionnements de la plaque de croissance peuvent entraîner un retard de croissance et des anomalies du développement osseux. Bien que l’étude de la plaque de croissance soit essentielle pour comprendre le développement osseux et les maladies associées, les recherches in vivo sont limitées en raison de ses transformations spatio-temporelles complexes. Récemment, les progrès des techniques d’impression 3D ont fourni de nouveaux modèles pour étudier les fonctions physiologiques et pathologiques de la plaque de croissance in vitro. Cependant, la simulation du processus d’ossification endochondrale reste un défi majeur dans la recherche sur les organoïdes osseux.

Cette étude vise à explorer le rôle du sous-type Cav3.3 des canaux calciques dépendants du voltage de type T (T-type Voltage-Dependent Calcium Channel, T-VDCC) dans la différenciation hypertrophique des chondrocytes, et à simuler le processus d’ossification endochondrale à l’aide d’un modèle d’hydrogel de gélatine méthacryloyle (Gelatin Methacryloyl, GelMA) imprimé en 3D. Cette recherche offre non seulement une nouvelle perspective pour comprendre le développement osseux, mais fournit également un support technique potentiel pour la construction d’organoïdes osseux.

Source de l’article

Cette recherche a été menée par Zhi Wang, Xin Wang, Yang Huang et leurs collègues du Chongqing Key Laboratory of Precision Medicine in Joint Surgery, Center for Joint Surgery, Southwest Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University). L’article a été publié en ligne le 26 novembre 2024 dans la revue Bio-design and Manufacturing, avec le DOI 10.1007/s42242-024-00287-1.

Processus et résultats de la recherche

1. Processus de recherche

a) Expériences animales et isolation des chondrocytes

L’étude a d’abord utilisé 12 souris C57BL/6 et 9 souris knock-out pour le gène Cacna1i (Cacna1i−/−), à différents âges (1, 2, 4 et 6 mois). La coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E) et au Safranin O/Fast Green a permis d’observer le développement de la plaque de croissance. Les résultats ont montré que la plaque de croissance des souris Cacna1i−/− présentait à 4 mois une ossification accélérée similaire à celle des souris sauvages de 6 mois, indiquant que Cav3.3 joue un rôle de régulation négative dans la maturation de la plaque de croissance.

b) Culture de chondrocytes et interférence avec Cav3.3

Les chondrocytes primaires ont été isolés des condyles fémoraux de souris, et la lignée cellulaire ATDC5 a été utilisée pour les expériences. Une technique de shRNA a permis de construire des cellules ATDC5 avec une suppression spécifique de Cav3.3 (shCav3.3). La diminution de l’expression de Cav3.3 a été validée par immunofluorescence, qRT-PCR et Western blot. Les résultats ont montré une réduction significative de l’expression de Cav3.3 dans les cellules shCav3.3, ainsi qu’une diminution marquée de la signalisation calcique intracellulaire.

c) Préparation de l’hydrogel GelMA et impression 3D

L’étude a utilisé un hydrogel GelMA à 5 % comme bio-encre pour construire un échafaudage de 5 mm × 5 mm × 1,5 mm par impression 3D. Les tests rhéologiques ont montré que l’hydrogel GelMA avait une bonne imprimabilité à 15°C. Après impression, l’échafaudage a été réticulé par irradiation aux UV à 405 nm pendant 10 secondes, avec un taux de survie cellulaire supérieur à 90 %. La microscopie électronique à balayage (SEM) a révélé une structure poreuse uniforme, adaptée à l’adhésion et à la prolifération cellulaire.

d) Culture 3D et analyse de l’expression des gènes liés à la différenciation hypertrophique

Les cellules shCav3.3 ont été chargées dans l’hydrogel GelMA pour une culture 3D, et l’analyse par séquençage d’ARNm a identifié des gènes différentiellement exprimés (DEGs). Les résultats ont montré que la suppression de Cav3.3 entraînait une régulation à la hausse des gènes liés à la matrice extracellulaire (ECM) et à la différenciation hypertrophique (comme Shh et TGF-β). Le Western blot et l’immunofluorescence ont confirmé une augmentation significative des marqueurs de chondrocytes hypertrophiques (comme Col-X, MMP-13 et Runx-2) et une diminution des marqueurs de cartilage hyalin (comme Col-II, Sox-9 et Acan) dans les cellules shCav3.3.

e) Processus de minéralisation et activité de la phosphatase alcaline (ALP)

La coloration au bleu Alcian et au rouge Alizarin S a permis d’évaluer la déposition d’ECM dans l’hydrogel GelMA. Les résultats ont montré une augmentation significative de la déposition de calcium dans le groupe shCav3.3, tandis que l’intensité des marqueurs de cartilage hyalin diminuait. De plus, l’activité ALP a augmenté de manière significative au fil du temps dans le groupe shCav3.3, confirmant le rôle de Cav3.3 dans la régulation de la différenciation hypertrophique et du processus de minéralisation des chondrocytes.

2. Principaux résultats

• Expression et fonction de Cav3.3 dans les chondrocytes : Cav3.3 est le sous-type de T-VDCC le plus exprimé dans les chondrocytes, et sa suppression réduit significativement la signalisation calcique intracellulaire et accélère la différenciation hypertrophique des chondrocytes.
• Imprimabilité et biocompatibilité de l’hydrogel GelMA : L’hydrogel GelMA à 5 % présente une bonne imprimabilité et biocompatibilité à 15°C, adapté à l’impression 3D.
• Promotion de la différenciation hypertrophique en culture 3D : En culture 3D, les cellules shCav3.3 montrent une tendance accrue à la différenciation hypertrophique, avec une régulation à la hausse des gènes liés à l’ECM et à la différenciation hypertrophique.
• Simulation du processus de minéralisation : L’hydrogel GelMA chargé de shCav3.3 a permis de simuler avec succès le processus de minéralisation de l’ossification endochondrale, fournissant une bio-encre fonctionnelle pour la construction future d’organoïdes de plaque de croissance minéralisés de manière ordonnée.

3. Conclusion et signification

Cette étude est la première à démontrer le rôle de régulation négative de Cav3.3 dans la différenciation hypertrophique des chondrocytes, et à simuler avec succès le processus d’ossification endochondrale à l’aide d’un modèle d’hydrogel GelMA imprimé en 3D. Cette recherche approfondit non seulement notre compréhension des mécanismes de développement osseux, mais offre également un support technique potentiel pour la construction d’organoïdes osseux. Les recherches futures pourraient explorer le potentiel thérapeutique de Cav3.3 dans les maladies du développement osseux et optimiser les techniques d’impression 3D pour construire des organoïdes osseux plus complexes.

4. Points forts de la recherche

• Perspective novatrice : Première démonstration du rôle de régulation négative de Cav3.3 dans la différenciation hypertrophique des chondrocytes.
• Méthode expérimentale innovante : Combinaison de techniques d’impression 3D et d’hydrogel GelMA pour simuler l’ossification endochondrale.
• Valeur applicative potentielle : Fournit une nouvelle plateforme technologique pour la construction d’organoïdes osseux et l’étude des maladies du développement osseux.

Conclusion

Cette étude, en régulant l’expression de Cav3.3, a révélé son rôle clé dans la différenciation hypertrophique des chondrocytes et a simulé avec succès le processus d’ossification endochondrale grâce à l’impression 3D. Cette recherche enrichit notre compréhension des mécanismes de développement osseux et ouvre de nouvelles perspectives pour la construction d’organoïdes osseux et le traitement des maladies associées.