Révélation des mécanismes de liaison entre un activateur de petite molécule et la protéine PR65 à l’aide de la technique des pinces optiques à molécule unique

Contexte académique

La phosphatase 2A (PP2A) est une enzyme clé dans la régulation des signaux cellulaires, dont le dysfonctionnement est étroitement lié à divers cancers et maladies chroniques, telles que la maladie d’Alzheimer et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Par conséquent, la réactivation de la PP2A est considérée comme une stratégie importante pour traiter ces maladies. Ces dernières années, des activateurs de petite molécule (SMAPs) ont été développés pour se lier directement à la sous-unité PR65 de la PP2A, rétablissant ainsi sa fonction. Cependant, les mécanismes de liaison entre PR65 et ces activateurs, ainsi que leurs effets sur la conformation de la protéine, restent peu clairs. Afin de résoudre ces inconnues, les chercheurs ont utilisé la technique des pinces optiques à molécule unique (NOTs) combinée à des simulations de dynamique moléculaire (MD) pour étudier la cinétique de liaison entre l’activateur ATUX-8385 et PR65 ainsi que ses effets conformationnels.

Source de l’article

Cet article a été réalisé par Annie Yang-Schulz, Maria Zacharopoulou, Semazeynep Yilmaz et leurs collègues, issus de diverses institutions, dont l’Université de Victoria, l’Université de Cambridge et l’Université de Stony Brook. Il a été publié en 2025 dans la revue npj Biosensing. Cette étude a bénéficié de financements multiples, incluant notamment le HFSP (référence RGP0027/2020) et le BBSRC (BB/T002697/1).

Processus de recherche et résultats

1. Processus de recherche

a) Expérimentation avec les pinces optiques à molécule unique

Les chercheurs ont utilisé la technique des double-nanopores de pinces optiques (DNH-NOTs) pour observer directement, sans marquage, le processus de liaison entre ATUX-8385 et PR65. Les étapes expérimentales étaient les suivantes : 1. Préparation des échantillons : La protéine PR65 a été mélangée à une solution comprenant 5 % de DMSO et 20 μM d’ATUX-8385. 2. Piégeage optique : Un faisceau laser a été focalisé sur un double-nanopore pour piéger un seul molécule de PR65. 3. Enregistrement du signal : Les variations du signal de diffusion lumineuse de PR65 (avant et après liaison) ont été enregistrées à l’aide d’une photodiode à avalanche (APD). 4. Analyse des données : Les signaux ont été analysés avec un modèle de Markov caché (HMM) pour différencier les états liés et non liés, permettant de calculer les constantes de vitesse d’association et de dissociation.

b) Simulations de dynamique moléculaire

Pour valider les résultats expérimentaux, les chercheurs ont réalisé des simulations de dynamique moléculaire : 1. Simulations de docking : Les logiciels Rosetta et AutoDock Vina ont été utilisés pour localiser le site potentiel de liaison de l’ATUX-8385 sur PR65. 2. Simulations de dynamique moléculaire : Des simulations totalisant 4,224 microsecondes ont été réalisées pour analyser les changements de conformation des états apo et liés de PR65. 3. Validation du site de liaison : Les résultats ont montré que l’ATUX-8385 se lie durablement à la région située entre les quatrième et cinquième répétitions hélicoïdales, stabilisant PR65 dans une conformation allongée.

c) Caractérisation biophysique

Pour compléter les données, les chercheurs ont utilisé les techniques suivantes : 1. Nano-différential scanning fluorimetry (nanoDSF) : Ils ont mesuré les changements de température de fusion ™ de PR65 en présence d’ATUX-8385, révélant une augmentation de la stabilité de la protéine après liaison. 2. Polarisation de fluorescence : En mesurant la polarisation de fluorescence, ils ont déterminé une constante de dissociation (Kd) de 9,4 ± 1,4 μM, en accord avec les résultats des expériences à molécule unique. 3. Résonance magnétique nucléaire (NMR) : Ils ont utilisé le spectre 19F de l’ATUX-8385 pour confirmer quantitativement l’interaction avec PR65.

2. Résultats principaux

a) Résultats des expérimentations à molécule unique

• Cinétique de liaison : Les expériences NOTs ont mesuré une constante de dissociation (Kd) de 13,6 ± 2,5 μM, correspondant aux résultats obtenus avec la polarisation de fluorescence.
• Changements conformationnels : Après liaison avec l’ATUX-8385, le signal de diffusion lumineuse s’est accru de manière significative, indiquant un passage de PR65 d’un état compact à un état allongé.

b) Résultats des simulations de dynamique moléculaire

• Site de liaison : L’ATUX-8385 se lie durablement dans une région entre les quatrième et cinquième répétitions hélicoïdales de PR65, validant les observations expérimentales.
• Stabilité conformationnelle : La liaison avec l’ATUX-8385 stabilise PR65 dans une conformation allongée, en accord avec les augmentations du signal de diffusion lumineuse observées expérimentalement.

c) Résultats de la caractérisation biophysique

• NanoDSF : La température de fusion de PR65 est passée de 52,7 ± 0,1 °C à 53,5 ± 0,1 °C en présence d’ATUX-8385, montrant une augmentation de stabilité structurale.
• Polarisation de fluorescence : La valeur mesurée de Kd (9,4 ± 1,4 μM) était similaire à celle obtenue dans les expériences à molécule unique.
• NMR : Une variation du signal 19F a confirmé l’interaction entre ATUX-8385 et PR65.

3. Conclusion et importance

Cette étude a révélé pour la première fois, au niveau d’une seule molécule, le mécanisme de liaison entre l’ATUX-8385 et PR65, ainsi que ses effets sur la conformation de la protéine. Les résultats montrent que l’ATUX-8385 favorise la conformation allongée de PR65, contribuant ainsi à la réactivation de PP2A. Ces découvertes fournissent une vue mécanistique profonde qui est précieuse pour le développement de thérapies ciblant PP2A. En outre, elles démontrent le potentiel significatif des techniques NOTs pour la découverte de médicaments.

4. Points forts de la recherche

• Étude au niveau moléculaire : Observation inédite de la cinétique de liaison entre l’ATUX-8385 et PR65 à l’échelle de la molécule unique.
• Validation par des techniques multiples : Utilisation combinée de NOTs, simulations MD, nanoDSF, polarisation de fluorescence et NMR pour vérifier les résultats.
• Applications pour la découverte de médicaments : Démonstration de la valeur des NOTs pour l’étude du criblage de médicaments et de la cinétique de liaison.

5. Informations supplémentaires

• Contrôle de température : Les NOTs permettent un contrôle local de la température via la puissance du laser, ouvrant la voie à des études sur l’impact thermique sur la cinétique de liaison.
• Données publiques : Les données et le code de cette étude sont disponibles sur GitHub (https://github.com/nanoplasmonics/smaps), facilitant la validation et les recherches futures.

Conclusion

Grâce à la technique innovante des pinces optiques à molécule unique, cette étude a révélé les mécanismes de liaison entre l’activateur de petite molécule ATUX-8385 et la protéine PR65, ainsi que les effets conformationnels associés. Ces résultats approfondissent la compréhension des mécanismes d’activation de PP2A et ouvrent de nouvelles perspectives pour la découverte de médicaments.