Génération de cellules CAR-NKT pour applications cliniques

Contexte de l’étude

La thérapie par cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR) a été approuvée par la Food and Drug Administration (FDA) pour traiter les tumeurs malignes des cellules B et le myélome multiple. Cependant, l’utilisation de produits à base de cellules CAR-T autologues pose des problèmes de coût élevé, de longs délais de fabrication et de difficulté d’accès pour les patients. En particulier, pour les patients présentant une progression de la maladie ou ayant reçu des traitements antérieurs, il peut ne pas y avoir suffisamment de cellules T fonctionnelles pour produire des cellules CAR-T. Afin de développer des produits de thérapie cellulaire prêts à l’emploi, deux approches sont explorées : l’une utilisant des cellules Tαβ conventionnelles, en supprimant l’expression du TCR endogène pour réduire les risques de maladie du greffon contre l’hôte (GVHD); l’autre utilisant des types de cellules avec un risque intrinsèquement faible de GVHD, comme les macrophages, les cellules NK et les cellules T invariantes NK (iNKT ou NKT).

Les cellules NKT sont un type spécialisé de cellules Tαβ caractérisées par une chaîne TCRα invariante et des marqueurs NK. En raison de leur reconnaissance des molécules CD1d non polymorphes, ces cellules ne déclenchent pas de GVHD comme les cellules T conventionnelles. Les cellules NKT montrent un potentiel pour le développement de thérapies cellulaires prêtes à l’emploi, avec une puissante activité tumoricide, une capacité à pénétrer les tumeurs et à connecter les réponses immunitaires innée et adaptative. Cependant, le développement des thérapies par cellules NKT est limité par la rareté des cellules NKT humaines et leur difficulté d’expansion à partir des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMCs). Il est donc significatif de trouver des méthodes adaptées cliniquement pour générer des cellules NKT allogéniques à partir d’autres sources.

Origine de l’étude

Cette étude a été rédigée conjointement par plusieurs chercheurs dont Yan-Ruide Li, Yang Zhou, Jiaji Yu, affiliés à plusieurs institutions, y compris l’Université de Californie, Los Angeles. Soumise le 23 août 2023, elle a été acceptée le 28 mars 2024 et sera publiée en ligne dans la revue “Nature Biotechnology”.

Processus de recherche

Détails du processus

1. Conception de l’étude:

   • Obtention de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) CD34+ à partir de sang de cordon ombilical humain congelé de fournisseurs commerciaux, utilisées pour générer des cellules NKT.
   • Étape 0 : Décongélation des HSPCs CD34+ et transduction virale pour insérer des gènes intéressants et le CAR.
   • Toute la culture se fait dans un environnement sans substrats ni sérum, conforme aux exigences cliniques.

2. Processus de génération de cellules :

   • Étape 1 : Expansion des HSPCs (2 semaines).
   • Étape 2 : Différenciation en cellules NKT (1 semaine).
   • Étape 3 : Différenciation supplémentaire en cellules NKT (1 semaine).
   • Étape 4 : Expansion des cellules NKT (2 semaines).

3. Détails expérimentaux et traitement des échantillons :

   • Pendant l’étape d’expansion des cellules NKT, deux stratégies alternatives ont été testées en utilisant des cellules nourricières humaines : des PBMCs de donneurs sains chargées d’α-galactosylcéramide (αGC) ou des cellules présentatrices d’antigène artificielles basées sur K562 (AAPCs), pour évaluer la faisabilité du développement clinique.
   • Les cellules NKT différenciées ont été analysées par cytométrie en flux pour déterminer leur phénotype et leur fonction.

4. Expériences principales :

   • Test des cellules CAR-NKT allogéniques (alloCAR-NKT) générées pour leur efficacité antitumorale, leur expansion et leur persistance dans un modèle de myélome multiple (MM).
   • Cytométrie en flux et séquençage de TCR monocellulaire dans la rate, la moelle osseuse et le sang périphérique pour vérifier l’expression uniforme du TCR NKT et d’autres antigènes tumoraux.

5. Analyse des données :

   • Analyse génomique par séquençage RNA monocellulaire (scRNA-seq) pour évaluer les profils d’expression génique à différents stades et dans différentes cellules traitées.
   • Intégration des données d’expression génique, d’analyse phénotypique et de tests fonctionnels pour révéler les performances et les mécanismes des cellules alloCAR-NKT dans un environnement antitumoral.

Résultats expérimentaux

1. Génération et expansion des cellules :

   • Les cellules alloCAR-NKT générées ont montré une grande cohérence en termes de rendement et de pureté, avec une expansion de plus de 1 000 000 fois des HSPCs CD34+ d’entrée aux cellules alloCAR-NKT matures en sortie.

2. Phénotype et fonction :

   • Les cellules alloCAR-NKT exprimaient un phénotype typique des cellules NKT en cytométrie en flux.
   • In vitro, les cellules allo/15bCAR-NKT (contenant un renforcement IL-15) montraient une forte fonction immunitaire, y compris des niveaux élevés de cytokines effectrices et de molécules cytotoxiques.
   • Les analyses ELISA et d’immunofluorescence ont montré des effets antitumoraux de ces cellules, incluant la destruction des cellules tumorales par des mécanismes multi-cibles (CAR, TCR et récepteurs NK).

3. Efficacité antitumorale :

   • Les cellules allo/15bCAR-NKT ont démontré une capacité significative de destruction des cellules tumorales dans plusieurs échantillons primaires de myélome multiple.
   • Dans un modèle de souris xénogreffé avec des MM humains, une dose unique de cellules allo/15bCAR-NKT a entraîné l’élimination de la tumeur et une survie prolongée des animaux.

4. Microenvironnement tumoral et échappement immunitaire :

   • Les cellules allo/15bCAR-NKT ont montré une capacité à éliminer de manière sélective les cellules suppressives immunitaires dans le microenvironnement tumoral (TME).
   • Tout en réduisant efficacement la tumeur, elles n’ont pas induit de GVHD significatif ni de syndrome de libération de cytokines (CRS).

Conclusions de l’étude

Les cellules alloCAR-NKT générées ont montré des caractéristiques exceptionnelles en termes de processus, de performance et de sécurité, incluant : - Une production cellulaire de haute pureté et cohérence. - Une capacité antitumorale multi-cibles ainsi qu’une survie cellulaire et des fonctions effectrices supérieures. - En conditions contrôlées, absence de GVHD et de CRS, démontrant un bon potentiel pour des applications cliniques.

Signification de l’étude

Cette étude montre qu’il est possible de produire avec succès des cellules CAR-NKT allogéniques efficaces en optimisant les méthodes de culture cellulaire guidées par des exigences cliniques, sans recourir à des cultures en trois dimensions ni à des conditions de nourrissage hétérologues. Ce résultat offre de nouvelles opportunités de thérapie cellulaire pour divers cancers hématologiques et tumeurs solides et pourrait être étendu à d’autres traitements de maladies.