LOXL1-AS1 favorise la progression du cholangiocarcinome en régulant la voie de signalisation JAK2/STAT3

Contexte académique

Le cholangiocarcinome (CCA) est une tumeur maligne issue de l’épithélium biliaire, présentant des défis médicaux importants. Son incidence varie géographiquement, étant particulièrement élevée en Asie et en Amérique du Sud. L’apparition du CCA est liée à divers facteurs tels que la cholécystite, la lithiase biliaire, la cirrhose et les infections par les virus de l’hépatite. Étant donné que les symptômes précoces sont souvent discrets, de nombreux patients sont diagnostiqués à un stade avancé, rendant la résection chirurgicale inefficace et le pronostic très défavorable. Actuellement, une recherche approfondie sur le mécanisme du CCA est cruciale pour développer des thérapies ciblées efficaces, augmenter le taux de survie et améliorer la qualité de vie des patients. Les longues chaînes d’ARN non codants (lncRNA) sont des molécules d’ARN de plus de 200 nucléotides, nommées en raison de leur incapacité à coder pour des protéines. Des études récentes ont montré que les lncRNA jouent un rôle clé dans divers processus biologiques, y compris l’initiation et le développement des tumeurs.

Source

Cette étude a été réalisée par une équipe de recherche de l’hôpital affilié n°2 de l’université médicale de Harbin en Heilongjiang, comprenant principalement Shaobo Yu, Xin Gao, Sidi Liu et d’autres. La recherche a été publiée en 2024 dans “Cancer Gene Therapy” (DOI: https://doi.org/10.1038/s41417-024-00726-2).

Processus de recherche

Échantillons cliniques

Nous avons collecté 65 paires de tissus tumoraux et non tumoraux chez des patients atteints de cholangiocarcinome. Ces échantillons ont été recueillis entre janvier 2013 et juillet 2018 à l’hôpital affilié n°2 de l’université médicale de Harbin, immédiatement congelés après la chirurgie et stockés à -80°C. Tous les patients ont signé un consentement éclairé et l’étude a été approuvée par le comité d’éthique.

Culture et transfection de cellules

La culture et la transfection ont été réalisées sur des lignées cellulaires normales des voies biliaires HIBEC et des lignées cellulaires de cholangiocarcinome CCLP-1, QBC939, RBE et HuCCT1. La réduction et la surexpression de LOXL1-AS1 ont été obtenues par transfection de siRNA et de plasmide.

qRT-PCR

L’ARN total des échantillons de cellules et de tissus a été extrait et rétro-transcrit en ADNc, suivi de l’analyse qRT-PCR pour détecter les niveaux d’expression des gènes cibles.

Expériences de viabilité cellulaire

La viabilité des cellules a été évaluée par les tests CCK-8 et EdU, et le potentiel de la membrane mitochondriale a été évalué par le test JC-1.

Test d’apoptose cellulaire

Le taux d’apoptose cellulaire a été déterminé par les tests TUNEL et la cytométrie en flux.

Tests de migration et d’invasion cellulaire

Les capacités de migration et d’invasion cellulaire ont été évaluées par le test de cicatrisation et le test Transwell.

Western Blot

L’expression des protéines liées à la voie de signalisation JAK2/STAT3 a été analysée par une expérience de western blot.

Expérience de localisation subcellulaire

La localisation de LOXL1-AS1 dans les cellules a été déterminée par une expérience de fractionnement subcellulaire et une expérience FISH.

Expérience de tirage d’ARN

L’interaction entre LOXL1-AS1 et la protéine JAK2 a été vérifiée par les tests de tirage d’ARN et RIP (RNA Immunoprecipitation).

Expérience in vivo

Des modèles de tumeurs sous-cutanées et de métastases ont été établis chez des souris nues, et évalués par coloration H&E et analyse immunohistochimique.

Principaux résultats

Surexpression de LOXL1-AS1 dans le CCA

Une surexpression significative de LOXL1-AS1 a été observée dans les tissus de cholangiocarcinome (figure 1a). Cette surexpression est significativement corrélée avec le stade TNM, les métastases ganglionnaires et le pronostic des patients (figures 1b-1e). L’évaluation par la méthode de Kaplan-Meier et la courbe ROC a montré que LOXL1-AS1 est étroitement liée à la DFS et à la OS des patients atteints de CCA (figure 1f).

Régulation de la prolifération et de l’apoptose tumorales par LOXL1-AS1

Les tests CCK-8 et EdU ont montré que la réduction de LOXL1-AS1 inhibe de manière significative la prolifération des cellules de cholangiocarcinome (figures 2c-2d), tandis que la surexpression de LOXL1-AS1 favorise leur prolifération. Les tests TUNEL et JC-1 montrent que la réduction de LOXL1-AS1 favorise de manière significative l’apoptose des cellules de cholangiocarcinome (figures 2e-2f). Dans l’expérience in vivo chez la souris, la réduction de LOXL1-AS1 inhibe de manière significative la croissance tumorale (figures 2g-2h).

Effet de LOXL1-AS1 sur la migration et l’invasion

Les tests de cicatrisation et Transwell montrent que la réduction de LOXL1-AS1 inhibe de manière significative la migration et l’invasion des cellules de cholangiocarcinome (figures 3a-3c). L’analyse des marqueurs EMT (transition épithélio-mésenchymateuse) montre que LOXL1-AS1 est étroitement liée au processus EMT (figure 3d). Les expériences in vivo montrent que la réduction de LOXL1-AS1 réduit de manière significative les métastases hépatiques et pulmonaires (figures 3e-3f).

Régulation de la voie de signalisation JAK2/STAT3 par LOXL1-AS1

Les expériences ont montré que LOXL1-AS1 se situe principalement dans le cytoplasme (figures 4a-4b). Des analyses bioinformatiques et des résultats expérimentaux supplémentaires indiquent que LOXL1-AS1 régule l’état de phosphorylation de JAK2, influençant ainsi la voie de signalisation JAK2/STAT3 (figures 4c-4d).

Impact de LOXL1-AS1 sur la dégradation ubiquitine-dépendante de JAK2

Les tests de tirage d’ARN et RIP ont confirmé l’interaction directe entre LOXL1-AS1 et JAK2 (figures 5a-5b). Après réduction de LOXL1-AS1, la dégradation de la protéine JAK2 s’accélère, tandis que l’utilisation de l’inhibiteur de protéasome MG132 empêche cette dégradation (figures 5d-5e). Les tests CO-IP (co-immunoprécipitation) ont montré que la réduction de LOXL1-AS1 augmente de manière significative le niveau d’ubiquitination de JAK2 (figure 5f).

Relation entre le facteur de transcription YY1 et LOXL1-AS1

Les analyses bioinformatiques et les tests expérimentaux ont montré que le facteur de transcription YY1 régule l’expression de LOXL1-AS1 en se liant aux sites promoteurs E1 et E2 en amont de LOXL1-AS1, principalement au site E2 (figures 7a-7c). L’impact de la réduction de LOXL1-AS1 sur les fonctions des cellules de CCA peut être inversé par la surexpression de YY1 (figures 7d-7i).

Discussion et conclusion

L’étude a montré que LOXL1-AS1 est surexprimé dans le cholangiocarcinome, corrélant de manière significative avec les caractéristiques cliniques et pathologiques ainsi que le pronostic des patients. LOXL1-AS1 favorise le développement du CCA en inhibant la dégradation ubiquitine-dépendante de JAK2 et en activant la voie de signalisation JAK2/STAT3. Le facteur de transcription YY1 régule l’expression de LOXL1-AS1, influençant ainsi les caractéristiques biologiques malignes du CCA. Ces découvertes fournissent des indices importants pour une meilleure compréhension des mécanismes pathogènes du CCA et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’étude suggère également la nécessité d’explorer davantage les interactions de LOXL1-AS1 avec d’autres molécules et son rôle dans d’autres voies de signalisation, afin de confirmer sa signification clinique dans une plus grande population de patients.