L’activation de l’inflammasome régule l’apoptose et la pyroptose des astrocytes dans des conditions ischémiques

Introduction

L’accident vasculaire cérébral ischémique est l’un des principaux mécanismes causant des lésions cérébrales, caractérisé par un manque d’oxygène et d’énergie dans une zone cérébrale localisée en raison d’une interruption du flux sanguin. Ces dernières années, il a été découvert que la réponse inflammatoire joue un rôle clé dans l’AVC ischémique. L’inflammasome est un complexe multiprotéique intracellulaire qui stimule principalement la réponse inflammatoire en activant les caspases pro-inflammatoires et en favorisant la maturation et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-1β et l’IL-18. Actuellement, de nombreuses études ont identifié le rôle de l’inflammasome dans la mort neuronale induite par l’AVC ischémique ainsi que dans l’activation et la mort des cellules microgliales, mais les mécanismes de régulation dans les astrocytes restent peu connus.

Contexte et motivation de la recherche

Dans le système nerveux central (SNC), les astrocytes sont le type de cellules gliales le plus abondant, principalement divisés en astrocytes fibreux et protoplasmiques. Les astrocytes fibreux sont principalement situés dans la substance blanche du cerveau et de la moelle épinière, responsables de la régulation de l’environnement extracellulaire autour des axones; tandis que les astrocytes protoplasmiques sont principalement situés dans la substance grise, fournissant un soutien métabolique aux neurones. Dans des conditions pathologiques telles que l’hypoxie-ischémie, l’activation, le dysfonctionnement et la mort des astrocytes accélèrent la détérioration de la conduction et l’expansion du noyau infarci. L’astrogliose réactive est une réponse typique des astrocytes aux lésions ischémiques, caractérisée par des changements morphologiques et fonctionnels ainsi qu’une augmentation de l’expression de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et des marqueurs inflammatoires. Cependant, il manque des études sur l’expression et l’activation de l’inflammasome dans les astrocytes dans des conditions ischémiques.

Cet article a été rédigé par une équipe de recherche multi-institutionnelle dirigée par Lap Jack Wong, comprenant des scientifiques de l’Université nationale de Singapour, de l’Université La Trobe et de l’Université Sungkyunkwan. L’article a été publié en ligne le 30 août 2023 dans la revue “Neuromolecular Medicine”.

Méthodes de recherche

Sujets d’étude et conception expérimentale

L’équipe de recherche a choisi une lignée d’astrocytes protoplasmiques (C8-D30) et une lignée d’astrocytes fibreux (C8-D1a) provenant de souris. Ces cellules ont été cultivées dans des milieux de culture spécifiques, et lorsque les cellules ont atteint 80-90% de confluence, elles ont été exposées à des conditions de privation d’oxygène et de glucose (OGD) pour simuler un environnement ischémique.

Les cellules ont été traitées en remplaçant le milieu par une solution tampon de Locke sans glucose et en les plaçant dans une atmosphère de 95% d’azote et 5% de dioxyde de carbone, puis traitées à différents points temporels allant de 1 heure à 24 heures. De plus, les cellules ont été traitées avec différentes concentrations (1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM) d’inhibiteur de caspase-1 pour observer son effet sur les composants de l’inflammasome et les marqueurs d’apoptose et de pyroptose.

Analyses biochimiques

Après l’expérience, les cellules ont été lavées avec du PBS et grattées, les protéines ont été extraites avec un tampon de lyse RIPA, et les lysats cellulaires ont été homogénéisés par sonication. La concentration totale de protéines a été déterminée à l’aide d’un kit de dosage de protéines BCA. La même méthode a été utilisée pour la précipitation et la collecte des protéines dans le milieu de culture. L’expression des composants de l’inflammasome, des cytokines pro-formes et des marqueurs de mort cellulaire a été analysée par SDS-PAGE et Western blot, et les données ont été quantifiées et analysées à l’aide des logiciels ImageJ et GraphPad Prism.

Analyse statistique

Les différences significatives entre les groupes ont été déterminées par analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie d’un test post-hoc de Bonferroni. Les données expérimentales sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard (SEM), avec un seuil de signification statistique fixé à p < 0,05.

Résultats de la recherche

Expression des composants de l’inflammasome et des cytokines pro-formes

Dans des conditions de privation d’oxygène et de glucose, les niveaux d’expression des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRRs) tels que NLRP1, NLRC4 et AIM2 ont augmenté significativement dans les astrocytes protoplasmiques. De plus, l’analyse de la série temporelle a révélé que les conditions OGD ont entraîné une augmentation significative de l’expression de NLRP1, NLRC4 et AIM2 dans les astrocytes protoplasmiques, avec une tendance à l’augmentation de NAIP à 9 heures.

En revanche, dans les astrocytes fibreux, les niveaux d’expression de NLRP1 et NLRC4 n’ont pas changé significativement dans des conditions OGD, tandis que l’expression de NAIP a relativement diminué. La protéine adaptatrice ASC et les caspases-1 et -8 totales ont montré une augmentation significative au fil du temps, tandis que l’expression de l’IL-1β pro-forme a diminué.

Activation de l’inflammasome et promotion de la mort des astrocytes

Sous l’analyse Western blot avec une électrochimiluminescence (ECL) de haute intensité, les formes clivées des caspases-1 et -8 et les formes matures d’IL-1β et IL-18, marqueurs de l’activation de l’inflammasome, ont toutes montré une expression accrue dans des conditions OGD, indiquant l’activation de l’inflammasome. Une analyse plus approfondie a montré que dans des conditions OGD, l’expression des marqueurs de mort cellulaire, y compris l’apoptose (caspase-3 clivée) et la pyroptose (gasdermine D N-terminale) ainsi que la pyroptose secondaire (gasdermine E N-terminale), a également augmenté significativement.

De plus, cette expérience a également révélé que les astrocytes peuvent libérer des composants de l’inflammasome dans le milieu de culture dans des conditions OGD, favorisant ainsi l’activation extracellulaire de l’inflammasome pour stimuler davantage la réponse inflammatoire.

Effet de l’inhibition de la caspase-1 sur l’activation de l’inflammasome et la mort des astrocytes

Grâce au traitement progressif avec l’inhibiteur de caspase-1, il a été constaté qu’il pouvait efficacement inhiber l’activation de l’inflammasome et la mort cellulaire dans des conditions OGD. Cela s’est manifesté par une diminution de l’expression des formes clivées de la caspase-1 et de l’IL-1β mature, ainsi qu’une réduction significative de l’expression des marqueurs d’apoptose et de pyroptose.

Conclusion

En résumé, cette étude établit le rôle important de l’inflammasome en tant que facteur de régulation de la réponse inflammatoire et de la mort cellulaire des astrocytes dans des conditions de privation d’oxygène et de glucose. L’inhibition de la caspase-1 peut efficacement réduire l’apoptose et la pyroptose, suggérant que l’inflammasome pourrait devenir une nouvelle cible pour le traitement de la mort des astrocytes induite par l’AVC ischémique. Cependant, il sera nécessaire de valider davantage ces résultats par des études in vivo à l’avenir pour comprendre en profondeur le rôle dynamique de l’inflammasome dans les astrocytes dans des conditions d’ischémie cérébrale. Cette étude jette des bases solides pour les futures recherches connexes tout en indiquant des directions importantes pour les recherches futures.

Points forts de la recherche

1. Effets différentiels de l’activation de l’inflammasome sur les astrocytes protoplasmiques et fibreux dans des conditions ischémiques : L’étude explore pour la première fois en détail l’expression et l’activation de l’inflammasome dans différents sous-types d’astrocytes dans des conditions ischémiques.
2. Révélation du rôle extracellulaire de l’inflammasome : Il a été démontré que les astrocytes peuvent promouvoir davantage la réponse inflammatoire en libérant des composants de l’inflammasome dans des conditions OGD.
3. Application efficace de l’inhibiteur de caspase-1 : La régulation pharmacologique de l’inflammasome offre une nouvelle direction de recherche et une voie de traitement potentielle pour la mort des astrocytes après un AVC ischémique.

Valeur de la recherche

Cette étude non seulement révèle le rôle de l’inflammasome dans des conditions ischémiques, mais fournit également des indices importants pour le développement futur de stratégies thérapeutiques anti-inflammatoires. En particulier dans le domaine de la protection des astrocytes et de la réduction de la neuroinflammation, les résultats de l’étude montrent la valeur potentielle des inhibiteurs de caspase-1, offrant une nouvelle perspective pour améliorer le pronostic des patients atteints d’AVC ischémique.