无铀染色技术在低真空扫描电子显微镜中的应用
无铀KMnO₄/Pb染色在低真空扫描电镜中实现组织结构的成像
学术背景
电子显微镜（Electron Microscopy, EM）是研究细胞和组织超微结构的最强大工具之一。然而，传统的生物样本金属染色方法通常需要使用有害的铀化合物，这限制了电子显微镜的广泛应用。近年来，随着超分辨率荧光显微镜的发展，许多细胞生物学家转向免疫细胞化学技术，但荧光标记仍然是这些技术的基础。因此，电子显微镜观察仍然是不可或缺的方法，并且在不断发展的设备和方法中，电子显微镜在生物学中的应用也在不断扩展。
低真空扫描电子显微镜（Low-Vacuum Scanning Electron Microscopy, LVSEM）允许对非导电样本进行高分辨率成像，因为它可以通过残余气体分子中的正离子中和非导电材料上积累的负电荷。然而，传统的金属染色方法需要使用铀化合物，这不仅对操作人员有害，还限制了LVSEM的广泛应用。因此，开发一种安全、快速且无铀的金属染色方法成为了一个重要的研究目标。
论文来源
本论文由Akira Sawaguchi、Takeshi Kamimura、Kyoko Kitagawa、Yoko Nagashima和Nobuyasu Takahashi共同撰写，分别来自日本宫崎大学医学部解剖学系超微结构细胞生物学部门和Hitachi High-Tech Corporation。该论文于2024年发表在《npj Imaging》期刊上，题为《KMnO₄/Pb staining allows uranium-free imaging of tissue architectures in low vacuum scanning electron microscopy》。
研究流程
1. 样本制备
研究使用10周龄的雄性Wistar大鼠，通过左心室灌注10%福尔马林（4%多聚甲醛）或2%多聚甲醛与2.5%戊二醛的混合液进行固定。随后，取出肾脏、肺、气管和耳廓等器官，进一步固定2小时，然后通过自动组织处理器进行脱水和石蜡包埋。最终，制备5微米或20微米厚的石蜡切片。
2. 光镜与LVSEM的关联成像
石蜡切片经过脱蜡和再水化后，进行苏木精和伊红（H&E）染色，随后在光镜下观察。观察后，切片在二甲苯中浸泡18-24小时以去除盖玻片，然后进行金属染色。
3. KMnO₄/Pb金属染色
切片首先用0.2%高锰酸钾（KMnO₄）处理5分钟，随后用雷诺铅柠檬酸溶液（Pb）染色3分钟。通过灰度直方图分析，确定了最佳的KMnO₄浓度和处理时间。
4. LVSEM成像
染色后的切片在LVSEM（Hitachi High-Tech Corporation的TM4000Plus II）下观察，加速电压为5、10、15或20 kV。通过半自动拼接技术，获得了整个切片的蒙太奇图像。
主要结果
1. KMnO₄/Pb染色的优化
通过灰度直方图分析，确定了最佳的KMnO₄浓度为0.2%，处理时间为5分钟。与传统的铀/铅（Ur/Pb）染色相比，KMnO₄/Pb染色在肾小球、尿细管、输尿管过渡上皮和甲状腺滤泡上皮等组织中表现出相似的染色效果和图像对比度。
2. 元素分析
元素分析显示，KMnO₄/Pb染色和Ur/Pb染色的背散射电子（Backscattered Electron, BSE）信号强度主要由铅（Pb）沉积量决定。KMnO₄氧化增强了Pb的沉积，从而提高了BSE信号强度。
3. 与其他无铀染色方法的比较
与铂蓝/铅（Pt-blue/Pb）、乌龙茶提取物/铅（Ote/Pb）和钐三乙酸/铅（Sm/Pb）等无铀染色方法相比，KMnO₄/Pb染色在肌肉动脉的内弹性膜和弹性软骨的间质基质中表现出更高的对比度。
4. 三维成像
KMnO₄/Pb染色应用于厚切片LVSEM，成功实现了肾小球、尿细管和肺支气管等组织的三维成像，展示了复杂的细胞/组织结构。
结论
本研究开发了一种无铀的KMnO₄/Pb金属染色方法，能够在低真空扫描电镜下对石蜡切片进行多尺度成像。该方法不仅安全、快速，而且图像对比度与传统的Ur/Pb染色相当，适用于超微结构观察。KMnO₄氧化增强了Pb的沉积，从而提高了BSE信号强度，特别是在弹性组织中表现出独特的染色效果。
研究亮点
- 无铀染色方法：KMnO₄/Pb染色避免了使用有害的铀化合物，为生物医学电子显微镜的广泛应用提供了新的途径。
- 多尺度成像：从厘米级的光镜观察到纳米级的LVSEM成像，实现了对复杂细胞/组织结构的全面分析。
- 三维成像：厚切片LVSEM结合KMnO₄/Pb染色，成功展示了细胞/组织的三维结构。
- 用户友好性：该方法无需特殊设备或技术，适用于常规病理诊断和回顾性研究。
意义与价值
本研究为生物医学研究提供了一种安全、高效的电子显微镜成像方法，特别是在组织病理学诊断和三维结构分析中具有重要应用价值。此外，该方法还可以用于回顾性研究，利用保存多年的石蜡切片进行超微结构分析，进一步推动了生物医学研究的发展。
通过开发无铀的KMnO₄/Pb染色方法，本研究不仅解决了传统染色方法的安全性问题，还为电子显微镜在生物医学领域的广泛应用开辟了新的道路。