3D生物打印GelMA水凝胶中Cav3.3介导的软骨内骨化研究

研究背景

骨骼发育是一个复杂的过程，其中生长板（Growth Plate, GP）在长骨的纵向生长中起着至关重要的作用。生长板通过软骨内骨化（Endochondral Ossification, EO）过程调控骨骼的成熟。然而，生长板功能障碍可能导致生长迟缓和骨骼发育不良。尽管生长板的研究对于理解骨骼发育和相关疾病具有重要意义，但由于其复杂的时空变化，体内研究受到限制。近年来，三维（3D）生物打印技术的发展为体外研究生长板的生理和病理功能提供了新的模型。然而，模拟软骨内骨化过程仍然是骨类器官研究中的一个关键挑战。

本研究旨在通过调控T型电压依赖性钙通道（T-type Voltage-Dependent Calcium Channel, T-VDCC）亚型Cav3.3，探索其在软骨细胞肥大分化中的作用，并利用3D生物打印的明胶甲基丙烯酰（Gelatin Methacryloyl, GelMA）水凝胶模型模拟软骨内骨化过程。这一研究不仅为理解骨骼发育提供了新的视角，还为骨类器官的构建提供了潜在的技术支持。

论文来源

该研究由来自Chongqing Key Laboratory of Precision Medicine in Joint Surgery, Center for Joint Surgery, Southwest Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University)的Zhi Wang、Xin Wang、Yang Huang等研究人员共同完成。论文于2024年11月26日在线发表在Bio-design and Manufacturing期刊上，DOI为10.1007/s42242-024-00287-1。

研究流程与结果

1. 研究流程

a) 动物实验与软骨细胞分离

研究首先使用12只C57BL/6小鼠和9只Cacna1i基因敲除小鼠（Cacna1i−/−），分别在不同年龄段（1、2、4、6个月）进行实验。通过苏木精-伊红（H&E）染色和番红O/快绿染色观察生长板的发育情况。结果显示，Cacna1i−/−小鼠的生长板在4个月时表现出与6个月野生型小鼠相似的加速骨化现象，表明Cav3.3在生长板成熟过程中起负调控作用。

b) 软骨细胞培养与Cav3.3干扰

研究从小鼠股骨髁分离出原代软骨细胞，并使用ATDC5细胞系进行实验。通过shRNA技术构建Cav3.3特异性敲低的ATDC5细胞（shCav3.3），并通过免疫荧光染色、定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot验证Cav3.3表达的下调。结果显示，shCav3.3细胞中Cav3.3的表达显著降低，且细胞内钙信号强度显著下降。

c) GelMA水凝胶的制备与3D生物打印

研究使用5% GelMA水凝胶作为生物墨水，通过3D生物打印技术构建了5 mm × 5 mm × 1.5 mm的水凝胶支架。流变学测试表明，GelMA水凝胶在15°C时具有良好的可打印性。打印后的水凝胶支架经过405 nm紫外光照射10秒进行交联，细胞存活率超过90%。扫描电子显微镜（SEM）显示，水凝胶支架具有均匀的孔隙结构，适合细胞粘附和增殖。

d) 3D培养与肥大分化相关基因表达分析

研究将shCav3.3细胞加载到GelMA水凝胶中进行3D培养，并通过mRNA测序分析差异表达基因（DEGs）。结果显示，Cav3.3敲低后，细胞外基质（ECM）相关基因和肥大分化相关基因（如Shh和TGF-β）显著上调。Western blot和免疫荧光染色进一步证实，shCav3.3细胞中肥大软骨细胞标志物（如Col-X、MMP-13和Runx-2）的表达显著增加，而透明软骨标志物（如Col-II、Sox-9和Acan）的表达显著降低。

e) 矿化过程与碱性磷酸酶（ALP）活性检测

研究通过阿利新蓝染色和茜素红S染色评估了GelMA水凝胶中ECM的沉积情况。结果显示，shCav3.3组的钙沉积显著增加，而透明软骨标志物的强度显著降低。此外，ALP活性检测表明，shCav3.3组的ALP活性随时间显著增加，进一步证实了Cav3.3在调控软骨细胞肥大分化和矿化过程中的作用。

2. 主要结果

• Cav3.3在软骨细胞中的表达与功能：Cav3.3是T-VDCC亚型中在软骨细胞中表达最高的亚型，其敲低显著降低了细胞内钙信号强度，并加速了软骨细胞的肥大分化。
• GelMA水凝胶的可打印性与细胞相容性：5% GelMA水凝胶在15°C时具有良好的可打印性和细胞相容性，适合用于3D生物打印。
• 3D培养环境对肥大分化的促进作用：3D培养环境下，Cav3.3敲低细胞表现出更强的肥大分化倾向，ECM相关基因和肥大分化相关基因显著上调。
• 矿化过程的模拟：shCav3.3加载的GelMA水凝胶成功模拟了软骨内骨化过程中的矿化过程，为未来构建分层有序的矿化生长板类器官提供了功能性生物墨水。

3. 结论与意义

本研究首次证实了Cav3.3在软骨细胞肥大分化中的负调控作用，并通过3D生物打印的GelMA水凝胶模型成功模拟了软骨内骨化过程。这一研究不仅为理解骨骼发育提供了新的分子机制，还为骨类器官的构建提供了潜在的技术支持。未来的研究可以进一步探索Cav3.3在骨骼发育疾病中的治疗潜力，并优化3D生物打印技术以实现更复杂的骨类器官构建。

4. 研究亮点

• 新颖的研究视角：首次揭示了Cav3.3在软骨细胞肥大分化中的负调控作用。
• 创新的实验方法：结合3D生物打印技术和GelMA水凝胶，成功模拟了软骨内骨化过程。
• 潜在的应用价值：为骨类器官的构建和骨骼发育疾病的研究提供了新的技术平台。

总结

本研究通过调控Cav3.3的表达，揭示了其在软骨细胞肥大分化中的关键作用，并利用3D生物打印技术成功模拟了软骨内骨化过程。这一研究不仅深化了我们对骨骼发育机制的理解，还为骨类器官的构建和相关疾病的治疗提供了新的思路。