BOK在Ser-8位点的磷酸化阻断其抑制IP3R介导的钙动员能力
BOK蛋白在钙信号调控中的新角色
背景介绍
BOK（Bcl-2-related ovarian killer）是Bcl-2蛋白家族的一员，长期以来被认为在细胞凋亡中发挥作用。然而，近年来的研究表明，BOK可能还具有非凋亡功能，特别是在钙离子（Ca²⁺）信号调控中。钙离子是细胞内重要的第二信使，参与多种细胞过程，包括细胞增殖、分化和凋亡。内质网（ER）是细胞内主要的钙离子储存库，而IP3受体（IP3R）是调控内质网钙离子释放的关键通道。BOK与IP3R的结合已被证实，但其对IP3R功能的直接影响尚不明确。此外，BOK的丝氨酸-8（Ser-8）位点是一个高度保守的磷酸化位点，但其功能意义尚未被充分研究。
本研究的目的是探索BOK及其磷酸化对IP3R介导的钙离子释放的调控作用，特别是通过Ser-8位点的磷酸化如何影响BOK与IP3R的相互作用及其对钙信号的影响。
论文来源
本论文由Caden G. Bonzerato、Katherine R. Keller和Richard J. H. Wojcikiewicz共同完成，他们均来自SUNY Upstate Medical University的药理学系。论文于2025年发表在Cell Communication and Signaling期刊上，题为《Phosphorylation of BOK at Ser-8 blocks its ability to suppress IP3R-mediated calcium mobilization》。
研究流程与结果
1. BOK的磷酸化研究
实验流程
- 体外磷酸化实验：研究人员使用细菌表达的His-SUMO标记的BOK蛋白（HS-BOKδTM），在体外通过cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）催化磷酸化反应。通过质谱分析（MS）确认Ser-8位点的磷酸化。
- 体内磷酸化实验：在αT3细胞中，研究人员使用PKA激活剂（如forskolin）和磷酸酶抑制剂（如calyculin A）处理细胞，通过免疫印迹（Western blot）和免疫共沉淀（Co-IP）技术检测BOK的磷酸化状态。
结果
- 体外实验：质谱分析证实，BOK的Ser-8位点被PKA磷酸化，且磷酸化后BOK与IP3R1的结合能力显著减弱。
- 体内实验：在αT3细胞中，PKA激活剂显著增加了BOK的磷酸化水平，且磷酸化BOK与IP3R1的结合能力下降。
2. BOK对IP3R1介导的钙离子释放的调控
实验流程
- 钙离子浓度测量：研究人员使用荧光钙离子染料（如Calcium 6）和基因编码的钙离子传感器（如R-CEPIA1er）测量细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]c）和内质网钙离子浓度（[Ca²⁺]er）。
- 细胞模型：研究使用了多种细胞模型，包括HEK-3KO细胞（缺乏所有IP3R亚型）和HEK-IP3R1细胞（仅表达IP3R1），以及αT3细胞和SH-SY5Y细胞（主要表达IP3R1）。
结果
- BOK对钙离子释放的抑制作用：在HEK-IP3R1细胞中，BOK显著加速了G蛋白偶联受体（GPCR）诱导的钙离子释放后的[Ca²⁺]c下降。这一效应依赖于BOK与IP3R1的结合，因为在不结合BOK的IP3R突变体中未观察到类似效应。
- 磷酸化对BOK功能的调控：当BOK的Ser-8位点被磷酸化或突变为磷酸模拟物（S8E）时，BOK对IP3R1介导的钙离子释放的抑制作用被逆转。
3. BOK与IP3R1相互作用的机制
实验流程
- 免疫共沉淀实验：研究人员通过Co-IP技术检测BOK与IP3R1的结合能力，并分析磷酸化对结合的影响。
- 内质网钙离子泄漏实验：使用thapsigargin（TG）抑制内质网钙离子泵（SERCA），测量钙离子泄漏速率。
结果
- 磷酸化减弱BOK与IP3R1的结合：磷酸化BOK或S8E突变体与IP3R1的结合能力显著减弱，表明Ser-8磷酸化通过削弱BOK与IP3R1的相互作用来调控钙离子释放。
- BOK抑制内质网钙离子泄漏：BOK显著抑制了IP3R1依赖的内质网钙离子泄漏，而磷酸化BOK或S8E突变体则失去了这一抑制作用。
结论与意义
本研究首次揭示了BOK通过其Ser-8位点的磷酸化调控IP3R1介导的钙离子释放。具体而言，BOK通过与IP3R1结合抑制钙离子释放，而Ser-8磷酸化则削弱了这一抑制作用。这一发现不仅拓展了BOK在钙信号调控中的功能，还为理解Bcl-2家族蛋白在非凋亡过程中的作用提供了新的视角。
研究亮点
- BOK的新功能：首次证明BOK通过调控IP3R1活性影响钙离子释放，揭示了其在钙信号调控中的非凋亡功能。
- 磷酸化的调控机制：Ser-8磷酸化通过削弱BOK与IP3R1的结合，逆转了BOK对钙离子释放的抑制作用。
- 细胞模型的多样性：研究使用了多种细胞模型，确保了结果的广泛适用性。
应用价值
本研究的发现为开发针对钙信号通路相关疾病的治疗策略提供了新的靶点。例如，通过调控BOK的磷酸化状态，可能有助于治疗与钙信号失调相关的疾病，如神经退行性疾病和心血管疾病。
其他有价值的信息
- 技术创新：研究中使用的高灵敏度质谱分析和基因编码钙离子传感器为未来的钙信号研究提供了强有力的工具。
- 跨学科合作：本研究结合了分子生物学、细胞生物学和生物化学等多学科技术，展示了跨学科研究在解决复杂生物学问题中的重要性。