一种用于深层和广域成像的大视场、单细胞分辨率的双光子和三光子显微镜

2025-02-14 Fri
大视场、单细胞分辨率的双光子与三光子显微镜用于深层和广域成像研究背景与问题提出多光子显微技术（Multiphoton Microscopy, MPM）是深组织成像的强大工具，尤其在活体脑功能研究中具有不可替代的地位。然而，传统的双光子显微镜（Two-Photon Microscopy, 2PM）虽然能够实现较大的成像视场（Field of View, FOV），但其成像深度通常局限于浅层皮质区域，难以穿透到大脑的深层结构。而三光子显微镜（Three-Photon Microscopy, 3PM）尽管可以实现更深的成像，但由于热损伤限制了激光重复率，导致其视场较小且成像通量较低。因此，如何在保持高分辨率的同时实现大视场（Large Field of View, LFOV）和深层成像，成为多光子显微技术领域亟待解决的问题。
为了解决这一问题，Aaron T. Mok等人开发了一种新型的多光子显微系统——DeepScope，该系统通过一系列创新技术优化了荧光信号生成效率，从而实现了大视场、单细胞分辨率的深层成像。这项研究旨在突破传统多光子显微镜的技术瓶颈，为神经回路系统层面的研究提供新的工具。
论文来源与作者信息这篇论文由Aaron T. Mok、Tianyu Wang、Chris Xu等研究人员撰写，其中第一作者Aaron T. Mok和通讯作者Chris Xu均来自美国康奈尔大学应用与工程物理学院（School of Applied and Engineering Physics, Cornell University）。其他作者分别来自波士顿大学、哈佛大学、麻省理工学院等知名机构。论文于2024年发表在开放获取期刊《eLight》上，文章标题为“A large field-of-view, single-cell-resolution two- and three-photon microscope for deep and wide imaging”。
研究方法与实验设计a) 研究流程与实验细节1. DeepScope系统的开发DeepScope是一种双激发自适应多边形扫描多光子显微镜（Dual Excitation with Adaptive Excitation Polygon-Scanning Multiphoton Microscope），其核心创新包括以下几点：
- 自适应激发（Adaptive Excitation）：利用电光调制器（Electro-Optic Modulators, EOMs）动态调整激光功率，在血管阴影区域降低功率，从而提高感兴趣区域的有效功率。
- 束斑扫描方案（Beamlet Scanning Scheme）：通过束斑延迟线将单一激光脉冲分割为两个时间间隔约20纳秒的束斑，从而有效提高了激光重复率并提升了扫描速度。
- 多边形扫描仪（Polygon Scanner）：采用大孔径（9.5毫米）多边形扫描仪，实现了高达6千赫兹的线扫描速率，显著优于传统振镜扫描仪。
2. 实验对象与样本处理研究主要以转基因小鼠（Transgenic Mice）和成年斑马鱼（Adult Zebrafish）为实验对象。实验过程中，研究人员对小鼠进行了慢性颅窗手术，并使用GCaMP6s钙指示剂标记神经元。对于斑马鱼，则通过麻醉和固定后进行全脑成像。
3. 实验步骤与测试内容小鼠脑部深层成像：利用DeepScope系统对小鼠皮质第6层（Layer 6, L6）和海马CA1区（Cornu Ammonis 1, CA1）进行结构和功能成像，验证系统的深层成像能力。
同时双光子与三光子成像：在同一视野内分别对浅层和深层皮质区域进行双光子和三光子成像，展示系统的多功能性。
斑马鱼全脑成像：对成年斑马鱼进行全脑结构成像，进一步验证系统的广域成像能力。
4. 数据分析算法研究人员开发了一套基于MATLAB的图像处理脚本，用于分离双光子和三光子信号，并结合Suite2P软件对钙活动数据进行运动校正、神经元分割和荧光信号提取。
b) 主要结果与数据分析1. 小鼠脑部深层成像DeepScope成功实现了直径3.5毫米的大视场成像，覆盖了小鼠大脑最深层皮质区域。实验数据显示，在600微米深度处，系统能够以4赫兹帧率记录917个神经元的自发活动。此外，通过对海马CA1区的成像，研究人员验证了系统在亚皮质区域的成像能力。
2. 同时双光子与三光子成像实验表明，DeepScope能够在同一视野内同时记录浅层和深层皮质区域的神经活动。例如，在320至600微米深度范围内，系统以11赫兹帧率记录了4523个神经元的钙活动。
3. 斑马鱼全脑成像DeepScope还展示了对成年斑马鱼全脑结构的成像能力，成像深度超过1毫米，视场大于3毫米。实验结果清晰显示了端脑、视顶盖和小脑区域的GCaMP6s标记核团，以及骨结构和纤维束的三次谐波信号（Third Harmonic Generation, THG）。
c) 研究结论与价值DeepScope的成功开发为多光子显微技术提供了新的解决方案，其主要贡献包括：
- 科学价值：实现了大视场、单细胞分辨率的深层成像，突破了传统多光子显微镜的技术限制。
- 应用价值：可广泛应用于神经科学、免疫学、肿瘤学等领域，为系统级神经回路研究和疾病模型分析提供重要工具。
d) 研究亮点技术创新：自适应激发和束斑扫描方案显著提高了荧光信号生成效率。
多功能性：支持双光子和三光子同时成像，满足不同深度区域的研究需求。
广域成像能力：首次实现了成年斑马鱼全脑结构的高分辨率成像。
e) 其他有价值的信息DeepScope的设计简单紧凑，易于集成到现有的多光子显微镜中，为生物医学研究实验室提供了实用性强的解决方案。
总结与意义Aaron T. Mok等人的研究不仅解决了多光子显微技术中的关键问题，还为未来神经科学研究提供了强有力的工具。DeepScope的开发标志着多光子显微技术迈入了一个新阶段，其创新性和实用性使其成为该领域的里程碑式成果。