阿尔茨海默病中斑块和小胶质细胞糖基化的独特模式
Alzheimer 病中斑块和小胶质细胞糖基化的独特模式
研究背景
阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆类型，并且是一种毁灭性的神经退行性疾病。AD 的特征包括两种病理特征：细胞外的 β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块和细胞内磷酸化Tau神经原纤维缠结（NFT）包涵体。在AD的病理中，小胶质细胞的失调也是一个关键特征。正常情况下，小胶质细胞会修剪突触、监视大脑的稳态威胁并清除细胞碎片。然而，在AD中，小胶质细胞会对病理性的聚集物作出反应，改变吞噬作用和细胞因子的分泌，这些因素可能对神经病理产生积极和消极的影响。
研究目的
本研究旨在用新的组合组织学技术，描述在经过尸检确诊的AD患者的脑组织中，O-和N-连接的唾液酸（SA）修饰的糖基化景观。唾液酸修饰的糖基（唾液酸化的糖基）在细胞间相互作用、细胞迁移、细胞粘附、免疫调节和膜兴奋性中起着重要作用。尽管先前的研究已经发现AD中存在唾液酸化的改变，但由于常用方法的空间分辨率有限，对于这些唾液酸修饰位于细胞或聚集体相关糖基的位置仍然知之甚少。
研究来源
本文的作者包括Caitlyn Fastenau、Madison Bunce、Mallory Keating、Jessica Wickline、Sarah C. Hopp和Kevin F. Bieniek，他们分别隶属于德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校的药理学系、格伦·比格斯阿尔茨海默病及神经退行性疾病研究所以及德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校的病理学和实验室医学系。本文发表于2024年，由《Brain Pathology》期刊出版。
研究方法
人脑组织的获取和处理
选择十个来自德州大学健康科学中心圣安东尼奥分校格伦比格斯研究所的尸检大脑进行研究。这些病例根据产后确诊为AD，其中包括高AD病理改变（n=7）、中等AD病理改变（n=1）和低AD病理改变（n=2）的综合评分。所有患者在生前都表现出AD的迹象。
左侧半脑在10%中性缓冲福尔马林中固定至少一个月，然后进行冠状切片处理，历时28小时，并用石蜡包埋成组织块。切片包括中额回、海马和小脑的标本，切片厚度为5μm。之后进行连续切片和组织学染色。
免疫组化和特定明场染色
通过一系列组织学和免疫组化染色来可视化 Aβ 斑块、小胶质细胞和磷酸化的Tau蛋白以及唾液酸修饰。这些染色包括使用双染色Chromogenic stain，特用于检测α-2,6 N-唾液酸和O-唾液酸。
具体步骤包括在组织切片上进行脱蜡、蒸煮抗原修复、使用抗体和相应的二抗进行反应、色原发色，以及尼罗蓝染色和盖片处理。使用定量数字病理技术来评估不同脑区中唾液酸化糖基的数量和分布。
数据分析
使用 Leica Aperio AT2 滑动扫描仪获取明场免疫组化图像，使用 Aperio ImageScope 软件进行处理。将这些图像与正对照组织进行比较，验证色彩反卷算法。定量病理学分析需对序列切片进行对齐，以确保每个感兴趣区域（ROI）在所有五个切片中位于相同位置。ROI 安置在中额回、海马 CA1和小脑分子层。当ROI 位于 Aβ 斑块的位置时，与其邻近的没有 Aβ 病理的区域（内部对照）进行比较。
荧光双重染色
为了更好地理解α-2,6 N-唾液酸化的小胶质细胞的作用，对 CD163 作为斑块相关小胶质细胞的标志物进行联合免疫荧光染色，并利用超高分辨率成像技术进行进一步分析。
主要结果
α-2,6 N-唾液酸在Aβ斑块中显著增加
研究发现α-2,6 N-酸在斑块环境中的平均百分比面积显著高于非斑块区域，不同脑区表现出显著性差异。其中，中额回和海马斑块区域的α-2,6 N-唾液酸显著高于没有斑块区域。
没有显著差异的O-唾液酸
对于O-唾液酸中性和硫酸盐修饰，虽然在斑块区域的某些亚型中表现出增加，但整体差异不明显。表明O-唾液酸在不同脑区与AD病理之间的关联较为薄弱。
小胶质细胞的α-2,6 N-唾液酸化
进一步分析显示，约65%的小胶质细胞在Aβ斑块中较高程度的α-2,6 N-唾液酸化。同样，高AD病理变化病例的中唾液酸化的小胶质细胞比低病理变化病例显著增多，尤其是在有斑块的区域。
Plaque和Diffused斑块的糖基化模式
在对核心和扩散斑块形态的细分研究中发现，虽无显著差异，但核心斑块周围的小胶质细胞α-2,6 N-酸化可能在斑块紧凑性上具有潜在作用。
Tau病理中的唾液酸化
研究还探讨了唾液酸化与磷酸化 tau 病理的关系，发现虽然hippocampus CA2区有较高的磷酸化 tau 病理表现，但α-2,6 N-唾液酸化的增加并不显著，且α-2,6 N-酸化与磷酸化 tau 之间没有显著的正相关。
重要结论与价值
总体而言，本研究通过新颖的组织学方法，在AD脑组织中首次系统地对N-和O-连接唾液酸的修饰进行了定位和定量研究。研究显示，AD中的小胶质细胞及其周围的病变环境中，N-连接唾液酸化显著增加。这一增在AD蛋白聚集物上可能具有潜在的治疗靶点意义，并提出了α-2,6 N-酸化小胶质细胞在AD病理中的功能性研究前景。
研究亮点
- 新颖的研究方法与技术：使用改进的组织学技术结合定量数字病理学，对唾液酸化进行精确定位。
- 重要发现：发现斑块相关小胶质细胞的 α-2,6 N-酸显著增加，表明其在应对AD 病理中的重要性。
- 潜在的治疗靶点：研究结果提供了新的治疗策略方向，即针对微胶质细胞糖基化的干预。
附加信息
研究得到美国国立卫生研究院和德州阿尔茨海默病研究与护理联盟等多个基金的支持。所有结果都基于来自AGORA平台的数据，该平台由AMP-AD联盟创建，支持AD目标发现。数据可以在 DOi:10.57718/agora-adknowledgeportal 上获取。
作者们对德州大学健康科学中心南德州阿尔茨海默病研究中心的大脑捐赠者和其家属表示衷心感谢。文章中使用的所有数据集数据已在补充数据中包含，并遵守伦理委员会的审核标准。
此研究为进一步了解AD小胶质细胞应对策略及糖基化修饰提供了宝贵的数据基础，并促使了对治疗AD潜在靶点的深入探索。