L型钙通道调节低强度脉冲超声（LIPUS）在培养的海马神经元中的兴奋作用

背景

近年来，超声刺激作为一种非侵入性技术被广泛应用于调节体内外神经元活动。然而，对于低强度脉冲超声（LIPUS）诱导的神经调制效应，其潜在机制仍然不明。本文旨在通过研究LIPUS对海马神经元自发活动和细胞内钙（Ca2+）稳态的兴奋效应，揭示这一机制。研究发现，LIPUS通过促进L型钙通道（LTCCs）增加细胞内Ca2+浓度，从而激活Ca2+依赖的信号通路如CaMKII-CREB通路，进而调节基因转录和蛋白表达。

研究来源

本文由Fan Wen-Yong等研究团队撰写，作者分别来自复旦大学生命科学学院生理与神经生物学系、同济大学物理学系声学研究所、浙江省人民医院等机构。文章于2024年3月在Neuroscience Bulletin在线发表。

研究流程

1. 实验设置

研究团队建立了LIPUS刺激装置，并结合全细胞膜片钳记录和Ca2+成像技术，对培养的海马神经元进行刺激和观察。LIPUS使用的频率为1 MHz，脉冲重复频率为0.3 Hz，工作循环为10%。实验包括电生理学实验、Ca2+成像实验和蛋白及mRNA表达实验，涉及不同尺寸的压电换能器（16 mm和25 mm）。

2. 海马神经元培养

实验使用1-2天龄的新生Sprague Dawley大鼠的海马神经元，进行细胞分离和培养。培养基为Neurobasal A，补充1% B27、1%谷氨酰胺和1%青霉素、链霉素。

3. Ca2+成像

细胞利用Ca2+探针Fura-2-AM监测细胞内Ca2+浓度的实时变化。实验表明，LIPUS刺激可显著增加细胞内Ca2+浓度，而且主要是通过Ca2+外流，而非储存的Ca2+释放。

4. 电生理学实验

LIPUS能显著增加海马神经元的自发动作电位（sAP）和自发兴奋性突触电流（sEPSC）的频率和幅度。这些现象持续超过10分钟，这表明LIPUS在短时间内对神经元具有较强的兴奋作用。

5. 蛋白和mRNA表达

通过Western blot和PCR实验，分别分析LIPUS对Ca2+依赖的信号通路（如CaMKIIα和CREB）的影响，结果表明LIPUS增加了磷酸化的CaMKIIα和核内转移的CREB，而CaV1.2和CaV1.3蛋白及其mRNA的表达量在24小时内没有明显变化。

研究结果

1. LIPUS激发自发神经元活动

LIPUS刺激显著提高了海马神经元自发动作电位和自发兴奋性突触电流的频率及幅度。其机制可能与突触连接间增强的信号传递有关，这表明超声可以增强神经元间的联通性。

2. 通过LTCCs介导钙离子内流

LIPUS通过LTCCs增加神经元内Ca2+浓度，并显著改变LTCCs的电生理特性，包括激活电位的超极化和失活电位的去极化。这些变化表明，LIPUS通过这些通道增加神经元的兴奋性。

3. 激活钙依赖的信号通路

LIPUS通过LTCCs增加的Ca2+内流，激活了CaMKII-CREB通路。体外实验证实，LIPUS增加了磷酸化的CaMKIIα，并通过CREB在核内的转移，使得神经元在较长一段时间内保持较高的兴奋水平。

4. LIPUS对LTCCs的长期影响

尽管LIPUS显著改变了钙通道的功能，但在24小时内对LTCCs的mRNA和蛋白表达量没有明显影响。这暗示LIPUS主要是通过调节通道的活性而非数量来实现神经兴奋的。

结论

本文首次揭示了低强度脉冲超声通过LTCCs调节海马神经元内Ca2+内流，从而激活CaMKII-CREB信号通路的机制。这一发现对超声技术在神经调控及其临床应用方面具有重要价值。

研究亮点

本研究的亮点在于揭示了LIPUS通过LTCCs增加神经元内Ca2+内流的具体机制，并首次证明了LIPUS对CaMKII-CREB信号通路的激活效应。本文为未来超声技术在神经调控中的应用提供了理论基础和实验数据支持。

意义和价值

LIPUS作为一种非侵入性技术，其在神经科学研究和临床应用中的潜力正在不断显现。本文的研究不仅有助于理解超声对神经元调控的具体机制，还为将来开发新的神经调控技术提供了理论依据。此外，LIPUS在治疗神经退行性疾病如帕金森病和中风等方面也具有广泛的应用前景。

通过本文的研究，可以进一步推动LIPUS技术的发展与应用，为神经科学研究和临床治疗提供新的思路和方法。