Le stress hyperosmotique favorise la translocation nucléaire de TFEB dans les cellules épithéliales tubulaires en fonction des signaux intracellulaires de Ca2+ via les canaux TRPML

Ces dernières années, l’autophagie cellulaire, en tant que mécanisme essentiel de dégradation et de recyclage intracellulaire, joue un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie cellulaire et dans la réponse à diverses conditions de stress. En particulier, dans les cellules épithéliales tubulaires proximales du rein, l’activité autophagique est essentielle pour faire face à des lésions rénales courantes telles que l’ischémie, les dommages toxiques et l’inflammation. Cependant, bien que le rôle de l’autophagie dans l’adaptation cellulaire au stress ait été largement étudié, les mécanismes moléculaires par lesquels le stress hyperosmotique induit l’autophagie restent mal compris. Le stress hyperosmotique, en tant que stress mécanique, peut affecter la fonction cellulaire en modifiant le gradient de pression osmotique entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule, mais la manière dont il régule spécifiquement la voie autophagique reste une énigme.

Le facteur de transcription EB (TFEB) est le principal régulateur transcriptionnel de la voie autophagie-lysosome. Il favorise l’autophagie en régulant l’expression des gènes liés à l’autophagie et aux lysosomes. L’activité de TFEB est régulée par des événements de phosphorylation ; lorsqu’il est déphosphorylé, TFEB se déplace du cytoplasme vers le noyau, activant ainsi la transcription des gènes liés à l’autophagie. Cependant, la manière dont le stress hyperosmotique régule la translocation nucléaire de TFEB via les voies de signalisation du calcium (Ca²⁺) et les canaux TRPML1 reste une question à explorer en profondeur.

Source de l’article

L’article intitulé “Hyperosmotic Stress Promotes the Nuclear Translocation of TFEB in Tubular Epithelial Cells Depending on Intracellular Ca²⁺ Signals via TRPML Channels” a été co-écrit par Takashi Miyano, Atsushi Suzuki, Hisaaki Konta et Naoya Sakamoto. Ils sont affiliés à l’Université des Sciences de Tokyo (Tokyo University of Science) et à l’École Supérieure de Conception des Systèmes de l’Université Métropolitaine de Tokyo (Tokyo Metropolitan University). L’article a été publié en ligne le 21 janvier 2025 dans la revue Cellular and Molecular Bioengineering, avec le DOI : 10.1007/s12195-024-00839-6.

Processus de recherche

Objectif de l’étude

Cette étude vise à élucider comment le stress hyperosmotique active l’autophagie via TFEB et les voies de signalisation du Ca²⁺, révélant ainsi les mécanismes de réponse cellulaire au stress mécanique. Plus précisément, l’équipe de recherche a utilisé du mannitol pour induire un stress hyperosmotique, observé le phénomène de translocation nucléaire de TFEB, et exploré le rôle des canaux TRPML1 et de la calcineurine dans ce processus.

Méthodes expérimentales

1. Culture cellulaire et stimulation hyperosmotique
   Les cellules épithéliales tubulaires rénales de rat NRK-52E ont été utilisées comme modèle expérimental. Les cellules ont été cultivées dans un milieu DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin, et traitées avec un milieu hyperosmotique contenant du mannitol lorsqu’elles atteignaient 80 % de confluence. Pour étudier le rôle de la voie de signalisation du Ca²⁺, l’équipe a utilisé le chélateur intracellulaire de Ca²⁺ BAPTA-AM et l’inhibiteur de la calcineurine FK-506. De plus, l’antagoniste TRPML1 ML-SI3 a été utilisé pour évaluer la fonction des canaux TRPML1.

2. Coloration immunofluorescente et évaluation de la translocation nucléaire
   La translocation nucléaire de TFEB a été observée par coloration immunofluorescente. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %, puis marquées avec un anticorps anti-TFEB et un anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488. Les noyaux ont été colorés avec du Hoechst 33342. L’intensité de la fluorescence dans le noyau et le cytoplasme a été quantifiée à l’aide du logiciel ImageJ pour évaluer le degré de translocation nucléaire de TFEB.

3. Extraction d’ARN et PCR quantitative en temps réel
   L’ARN total a été extrait des cellules NRK-52E et transcrit en ADNc. L’expression des gènes cibles de TFEB (tels que LC3, VPS18, LAMP1 et LAMP2) a été détectée par PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR). Les données ont été normalisées par la méthode 2−ΔΔCt.

4. Analyse par Western blot
   Le niveau de phosphorylation de p70S6K a été analysé par Western blot pour évaluer l’activité de mTORC1. De plus, le niveau de protéine LC3-II a été analysé comme marqueur de l’autophagie. Les fractions nucléaires et cytoplasmiques ont été séparées à l’aide d’un kit de fractionnement nucléaire/cytoplasmique, avec GAPDH et Lamin A/C comme contrôles internes.

Principaux résultats

1. Le stress hyperosmotique induit par le mannitol favorise la translocation nucléaire de TFEB
   Les résultats expérimentaux montrent que le traitement au mannitol a significativement favorisé la translocation de TFEB du cytoplasme vers le noyau, atteignant un pic après une heure. En revanche, le traitement à l’urée n’a pas modifié de manière significative la localisation nucléaire de TFEB, indiquant que la translocation nucléaire de TFEB est étroitement liée au stress mécanique induit par la contraction cellulaire.

2. La voie de signalisation du Ca²⁺ régule la translocation nucléaire de TFEB
   L’utilisation de BAPTA-AM pour chélater le Ca²⁺ intracellulaire a complètement inhibé la translocation nucléaire de TFEB, tandis que l’utilisation d’EGTA pour chélater le Ca²⁺ extracellulaire n’a eu aucun effet significatif. Cela indique que le Ca²⁺ intracellulaire joue un rôle clé dans l’activation de TFEB induite par le stress hyperosmotique.

3. Rôle de la calcineurine dans la translocation nucléaire de TFEB
   Le stress hyperosmotique a significativement activé la calcineurine, comme en témoigne la translocation nucléaire de son facteur de transcription en aval, NFAT. L’inhibition de la calcineurine par FK-506 a significativement inhibé la translocation nucléaire de TFEB, indiquant que la calcineurine joue un rôle important dans l’activation de TFEB induite par le stress hyperosmotique.

4. Rôle du canal TRPML1 dans la translocation nucléaire de TFEB
   L’antagoniste TRPML1 ML-SI3 a significativement inhibé la translocation nucléaire de TFEB et l’augmentation de LC3-II induites par le stress hyperosmotique, indiquant que le canal TRPML1 active la calcineurine en libérant du Ca²⁺, favorisant ainsi la translocation nucléaire de TFEB et l’autophagie.

Conclusion

Cette étude montre que le stress hyperosmotique induit par le mannitol active TFEB via les canaux TRPML1 et la calcineurine, favorisant ainsi sa translocation nucléaire et l’expression des gènes liés à l’autophagie. Cette découverte non seulement révèle les mécanismes moléculaires de l’autophagie induite par le stress hyperosmotique, mais fournit également de nouvelles perspectives sur la manière dont les cellules transforment le stress mécanique en réponses biologiques.

Points forts de la recherche

1. Révélation d’un nouveau mécanisme d’induction de l’autophagie par le stress hyperosmotique
   Cette étude est la première à élucider le rôle clé des canaux TRPML1 et de la calcineurine dans la translocation nucléaire de TFEB induite par le stress hyperosmotique, comblant ainsi une lacune dans ce domaine.

2. Fourniture de cibles potentielles pour le traitement des maladies rénales
   La modulation des voies TFEB et TRPML1 pourrait offrir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies rénales associées à des dysfonctionnements de l’autophagie.

3. Conception expérimentale innovante
   L’équipe de recherche a combiné plusieurs techniques, telles que la coloration immunofluorescente, le Western blot et la RT-qPCR, pour systématiquement révéler les mécanismes moléculaires de l’autophagie induite par le stress hyperosmotique, fournissant ainsi une référence expérimentale importante pour les recherches dans ce domaine.

Signification de la recherche

Cette étude approfondit non seulement notre compréhension des mécanismes de l’autophagie induite par le stress hyperosmotique, mais fournit également une base théorique pour le développement de nouveaux traitements des maladies rénales. De plus, les résultats de cette recherche ouvrent de nouvelles voies pour explorer les réponses cellulaires liées à d’autres types de stress mécanique.