本文发表于2024年6月的《Nature Biomedical Engineering》期刊，题为“Localization of Protoporphyrin IX During Glioma-Resection Surgery via Paired Stimulated Raman Histology and Fluorescence Microscopy”。该研究由多个机构的科研团队合作完成，主要作者包括Dieter Henrik Heiland和Daniel Orringer等，研究机构包括纽约大学朗格尼医学中心、维也纳医科大学、明斯特大学医院和弗莱堡大学医学中心等。
胶质瘤（glioma）是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤之一，手术切除是其主要治疗手段。然而，胶质瘤的边界往往难以清晰界定，尤其是在高分级胶质瘤（high-grade glioma, HGG）中，如何在最大程度切除肿瘤的同时保护神经功能是一个重大挑战。5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid, 5-ALA）是目前广泛应用于胶质瘤手术中的荧光引导剂，其通过诱导肿瘤细胞内积累荧光物质原卟啉IX（protoporphyrin IX, PpIX）来帮助外科医生识别肿瘤组织。然而，现有的5-ALA荧光检测技术在肿瘤边缘的敏感性较低，且PpIX的积累机制尚不完全清楚。
本研究旨在通过开发一种结合受激拉曼组织学（stimulated Raman histology, SRH）和双光子激发荧光显微镜（two-photon excitation fluorescence microscopy, TPEF）的多模态光学系统，改进PpIX的临床检测，并揭示其在胶质瘤组织中的分布规律。研究还希望通过空间转录组学、代谢组学和RNA测序等多组学分析，进一步探讨PpIX积累的细胞类型及其在肿瘤免疫微环境中的作用。
研究团队开发了一种新型的多模态光学显微镜系统，能够同时进行SRH和TPEF成像。该系统基于现有的FDA注册的SRH显微镜，增加了双通道荧光检测模块，能够在同一光学切片中同时获取SRH和TPEF图像。研究纳入了来自四个医疗机构的115名高分级胶质瘤患者的新鲜肿瘤标本，利用该系统对PpIX的分布进行了详细分析。
研究的主要步骤包括： 1. 多模态光学系统的开发与验证：研究团队对现有的SRH显微镜进行了改进，增加了TPEF模块，并通过PpIX的系列稀释实验验证了系统的灵敏度。 2. 组织样本的成像与分析：对115名患者的肿瘤标本进行了SRH和TPEF成像，并通过半监督聚类方法对PpIX的荧光模式进行了分类。 3. 空间转录组学分析：对成像后的组织进行了空间转录组学分析，结合外部代谢组学和RNA测序数据集，验证了PpIX在肿瘤相关巨噬细胞中的积累。 4. 数据整合与统计分析：通过QuPath软件对细胞密度和荧光强度进行了量化分析，并利用线性回归模型评估了PpIX荧光模式与组织细胞密度之间的关系。
研究的主要发现包括： 1. PpIX的荧光模式：通过半监督聚类分析，研究团队识别出了五种不同的PpIX荧光模式，包括细胞外和细胞内的PpIX积累模式。 2. PpIX在肿瘤相关巨噬细胞中的积累：空间转录组学和外部多组学数据集的分析表明，PpIX主要积累在肿瘤相关巨噬细胞中，而非肿瘤细胞。 3. 组织细胞密度与荧光强度的关系：研究发现，组织细胞密度与PpIX荧光强度之间呈弱负相关，这与传统的假设（即PpIX荧光强度与肿瘤细胞密度正相关）相矛盾。
本研究通过开发新型多模态光学系统，揭示了PpIX在胶质瘤组织中的分布规律，并首次发现PpIX主要积累在肿瘤相关巨噬细胞中，而非肿瘤细胞。这一发现挑战了现有的关于5-ALA诱导荧光的机制假设，并为理解胶质瘤免疫微环境提供了新的视角。此外，研究还展示了光学成像技术在临床荧光引导手术中的潜力，为未来开发更精确的肿瘤切除技术奠定了基础。
研究还探讨了PpIX积累与血脑屏障通透性之间的关系，并提出了未来研究的方向，包括对未受累脑组织、肿瘤边缘和核心区域的系统比较，以进一步揭示PpIX在胶质瘤中的分布机制。