基于脱氨酶的全基因组单细胞和单分子转录因子足迹分析技术

生物化学 细胞生物学 遗传学 生命科学
转录因子 脱氨酶 单分子测序 单细胞基因组学 转录因子结合协同性

基因组范围内单细胞和单分子水平的转录因子足迹分析

学术背景

在人类和其他哺乳动物中，尽管每个体细胞的基因组基本相同，但不同细胞类型的功能却大相径庭。这种差异主要由转录因子（Transcription Factors, TFs）与基因调控区域的结合所决定，TFs通过控制DNA转录为RNA的过程来调控基因表达。理解TFs如何与基因组结合是功能基因组学研究中的核心问题之一。然而，现有的研究方法存在一定的局限性。传统的“自下而上”方法（如原子分辨率结构和单分子成像）和“自上而下”方法（如经典遗传学和分子生物学）虽然提供了许多有价值的信息，但无法在单细胞和单分子水平上全面揭示TFs的结合模式。

为了克服这些限制，本研究开发了一种名为“基于脱氨酶的足迹分析”（Footprinting with Deaminase, FOODIE）的新技术，能够在单细胞和单分子水平上对TFs的结合位点进行全基因组范围的精确检测。该技术不仅能够揭示TFs的结合位点，还能检测相邻TFs之间的协同作用，从而为理解基因调控网络提供了新的视角。

论文来源

本论文由Runsheng He、Wenyang Dong、Zhi Wang等来自Changping Laboratory、Peking University等机构的科研团队共同完成，并于2024年12月17日发表在《PNAS》期刊上。论文的通讯作者为Xiaoliang Sunney Xie，其团队在单分子基因组学和转录调控领域具有深厚的研究背景。

研究流程

1. FOODIE技术的开发与优化

FOODIE技术的核心思想是通过双链DNA脱氨酶（Deaminase）对DNA进行修饰，TFs的结合会保护其结合位点的胞嘧啶不被脱氨，从而在单分子测序中留下足迹。研究团队首先测试了多种脱氨酶，最终选择了DDDB和MGYPDA829这两种酶，因为它们能够在广泛的序列背景下高效地将胞嘧啶转化为尿嘧啶。

2. 实验流程

FOODIE的实验流程包括以下几个关键步骤：

  1. 细胞透化与染色质开放区域富集：使用Tn5转座酶对细胞进行透化处理，富集染色质开放区域，这些区域通常是TFs结合的主要位点。
  2. 脱氨反应：在Tn5处理后，加入脱氨酶进行反应，TFs的结合位点由于空间位阻不会被脱氨，而未结合的区域则会被修饰。
  3. 单分子测序：对经过脱氨处理的DNA进行单分子测序，通过分析胞嘧啶的转化率来识别TFs的结合位点。
  4. 数据分析：开发了专门的算法和网络服务器（http://foodie.sunneyxielab.org）用于数据的可视化和分析。

3. 单细胞FOODIE（scFOODIE）的应用

为了在异质组织中进行细胞类型特异性TFs足迹分析，研究团队开发了单细胞FOODIE技术。通过对小鼠海马体中的约11,200个细胞进行分析，成功识别了八种主要细胞类型，并检测了不同细胞类型中TFs的结合模式。例如，在海马体锥体细胞中检测到了AP-1的足迹，这与AP-1在突触活动和可塑性中的已知功能一致。

主要结果

1. TFs足迹的全基因组分布

通过FOODIE技术，研究团队在全基因组范围内绘制了TFs的结合位点，并发现TFs的结合位点主要分布在基因的启动子和增强子区域。例如，CTCF的结合位点主要位于转录起始位点（TSS）的上游，而YY1的结合位点则位于下游。

2. TFs协同作用的检测

FOODIE技术还能够检测相邻TFs之间的协同作用。研究发现，某些TFs之间存在正协同作用（如RFX和CREB），而另一些TFs之间则存在负协同作用（如NRF1的两个结合位点）。这种协同作用可能是通过蛋白质-蛋白质相互作用或竞争性结合来实现的。

3. 基因模块中的共享TFs

研究团队还发现，执行特定生物学功能的基因模块（Correlated Gene Modules, CGMs）通常由共享的TFs调控。例如，在细胞周期相关的基因模块中，E2F因子在启动子区域显著富集，而在免疫系统调控的基因模块中，RelB在增强子区域显著富集。这表明，不同基因模块的调控模式存在显著差异。

结论与意义

FOODIE技术为在单细胞和单分子水平上研究TFs的结合模式提供了强大的工具。该技术不仅能够精确检测TFs的结合位点，还能揭示相邻TFs之间的协同作用，从而为理解基因调控网络提供了新的视角。此外，FOODIE技术具有高通量、低成本的优势，有望在临床样本和人类组织中得到广泛应用。

研究亮点

  1. 高精度检测：FOODIE技术能够在单细胞和单分子水平上对TFs的结合位点进行全基因组范围的精确检测。
  2. 协同作用分析：该技术能够检测相邻TFs之间的协同作用，为理解基因调控网络提供了新的视角。
  3. 广泛应用前景：FOODIE技术具有高通量、低成本的优势，适用于多种细胞类型和组织样本。

其他有价值的信息

研究团队还开发了一个开放数据库（http://foodie.sunneyxielab.org），用于存储和共享FOODIE技术生成的数据。该数据库为其他科研人员提供了宝贵的研究资源，有望推动转录调控领域的进一步发展。

通过本研究，我们不仅深入理解了TFs在基因调控中的作用，还为未来的功能基因组学研究提供了新的技术手段。