学术背景与问题提出

线粒体作为真核细胞中至关重要的细胞器，参与了细胞的能量代谢、信号传导以及细胞生存与死亡的调控。线粒体功能障碍与多种人类疾病相关，包括神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病和癌症等。因此，研究线粒体的动态变化对于理解其生物学功能及其在疾病中的作用具有重要意义。然而，传统的电子显微镜（EM）虽然具有极高的空间分辨率，但只能用于固定样本，无法捕捉线粒体的动态变化。荧光显微镜虽然可以用于活体样本的观察，但其分辨率有限，尤其是在三维（3D）重建和长时间成像中，光漂白（photobleaching）问题严重影响了定量分析的准确性。

光漂白是指荧光分子在光照下发生不可逆的化学变化，导致荧光信号逐渐减弱的现象。这一问题在长时间成像中尤为突出，限制了线粒体等细胞器的动态研究。尽管已有多种方法试图校正光漂白的影响，但这些方法通常依赖于复杂的算法或假设，可能引入人为误差。因此，开发一种能够在活体样本中进行高分辨率成像并有效应对光漂白的技术，成为了当前研究的重要挑战。

论文来源与作者信息

本论文由来自英国伦敦大学学院（University College London）细胞与发育生物学系的研究团队完成，主要作者包括Segos Ioannis、Van Eeckhoven Jens、Greig Alan、Redd Michael、Thrasivoulou Christopher和Conradt Barbara。该论文于2024年发表在npj Imaging期刊上，题为《Impact of photobleaching on quantitative, spatio-temporal, super-resolution imaging of mitochondria in live C. elegans larvae》。

研究流程与实验方法

1. 机械固定C. elegans幼虫

为了在活体样本中进行超分辨率（super-resolution, SR）成像，研究团队开发了一种基于聚苯乙烯纳米珠（polystyrene nanobeads）的机械固定方法。这种方法无需使用药物，能够有效固定C. elegans幼虫，使其在成像过程中保持静止。具体步骤如下：

1. 样本准备：将C. elegans幼虫放置在10%琼脂糖垫上，并覆盖盖玻片。
2. 固定过程：通过纳米珠的摩擦力和盖玻片的压力，将幼虫固定在琼脂糖垫上，确保其在成像过程中不会移动。
3. 成像条件：幼虫的左侧与盖玻片接触，确保目标细胞（如ql.p神经母细胞）能够进行超分辨率成像。

2. 超分辨率时间序列成像

研究团队使用Zeiss LSM980显微镜的Airyscan SR模式进行成像，实现了单个线粒体的分辨率。具体步骤如下：

1. 转基因株系构建：构建了表达线粒体基质标记物（mtGFP）的转基因C. elegans株系，用于标记线粒体。
2. 成像参数：使用63×油浸物镜，分辨率为120 nm（xy）和360 nm（z），每1分钟采集一次图像。
3. 图像处理：通过多步时间序列成像，捕捉线粒体在细胞分裂过程中的动态变化。

3. 图像处理与3D重建

为了定量分析线粒体的动态变化，研究团队开发了一套图像处理流程，包括以下几个步骤：

1. 图像对齐：由于幼虫在成像过程中仍会有轻微移动，研究团队通过图像对齐技术校正了线粒体的位置。
2. 图像减法：为了消除荧光信号的重叠，研究团队从mtGFP图像中减去了mCherry信号。
3. 图像裁剪：裁剪出包含目标细胞的区域，减少图像处理的计算量。
4. 去卷积：使用Richardson-Lucy算法对图像进行去卷积处理，提高图像的分辨率。
5. 3D渲染：使用Imaris软件对线粒体进行3D重建，定量分析其体积、形态和分布。

4. 光漂白的影响分析

研究团队通过多步时间序列成像，分析了光漂白对线粒体荧光信号的影响。结果表明，尽管光漂白导致荧光信号逐渐减弱，但基于全局阈值（global thresholding）的图像分割方法不受光漂白的影响，能够准确量化线粒体的数量。

主要研究结果

1. 机械固定的有效性：研究团队开发的机械固定方法能够有效固定C. elegans幼虫，使其在成像过程中保持静止，且不会影响其正常发育。
2. 超分辨率成像的实现：通过Airyscan SR模式，研究团队成功捕捉了线粒体在细胞分裂过程中的动态变化，实现了单个线粒体的分辨率。
3. 图像处理流程的优化：研究团队开发的图像处理流程能够有效校正细胞移动和荧光信号重叠，实现了线粒体的3D重建。
4. 光漂白的影响：尽管光漂白导致荧光信号逐渐减弱，但基于全局阈值的图像分割方法不受光漂白的影响，能够准确量化线粒体的数量。

研究结论与意义

此研究开发了一种能够在活体样本中进行超分辨率成像并有效应对光漂白的技术，为研究线粒体等细胞器的动态变化提供了新的工具。研究结果表明，基于全局阈值的图像分割方法不受光漂白的影响，能够准确量化线粒体的数量，这一发现将推动荧光显微镜在定量研究中的应用。

研究亮点

1. 新型机械固定方法：研究团队开发的基于纳米珠的机械固定方法无需使用药物，能够有效固定C. elegans幼虫，适用于多种生物学研究。
2. 超分辨率成像的实现：通过Airyscan SR模式，研究团队成功捕捉了线粒体在细胞分裂过程中的动态变化，实现了单个线粒体的分辨率。
3. 光漂白问题的解决：研究结果表明，基于全局阈值的图像分割方法不受光漂白的影响，能够准确量化线粒体的数量，这一发现将推动荧光显微镜在定量研究中的应用。

其他有价值的信息

研究团队还探讨了不同荧光蛋白（如GFP和mKate2）在光漂白下的表现，结果表明，基于全局阈值的图像分割方法适用于多种荧光蛋白和细胞器标记物。此外，研究团队还提出了图像直方图（image histogram）在光漂白下的变化规律，为开发新的图像分析工具提供了理论依据。

总结

此研究通过开发新型机械固定方法和优化图像处理流程，成功实现了在活体样本中进行超分辨率成像，并有效应对了光漂白问题。这一技术为研究线粒体等细胞器的动态变化提供了新的工具，具有重要的科学和应用价值。