使用自监督深度学习解决冷冻电镜中的偏好取向问题

2025-01-27 Mon
克服单粒子冷冻电镜中的优选取向问题：深度学习的创新解法背景介绍近年来，单粒子冷冻电子显微镜（Single-Particle Cryo-EM）技术因其能够解析生物大分子在接近天然状态下的原子分辨率结构，已成为结构生物学领域的核心技术。然而，在实际应用中，研究者一直面临一个棘手的技术瓶颈，即“优选取向”（Preferred Orientation）问题。这一问题主要由于生物分子在冷冻电镜网格上分布不均，导致在某些方向上的数据采样不足。这种取向偏差通常是由样品制备过程中分子与空气-水界面（Air-Water Interface, AWI）或支撑膜-水界面的相互作用引起的。
优选取向问题在三维重构中显得尤为突出，因为它带来的各向异性（Anisotropy）会使三维结构受损，甚至失真，具体表现为二级结构偏斜、肽链断裂、密度不连续等问题，最终影响分子模型的构建及精确性。这种问题特别对低对称性或不对称性分子具有严重影响。在以往的研究中，解决优选取向问题的方式主要集中在生物化学和物理学领域，如调整样品制备方法、使用不同的支撑膜和添加试剂来改变分子行为。然而，这些方法通常复杂、耗时且昂贵，有时还可能引入新的干扰，例如较高的背景噪声或新的优选取向问题。
为克服这一难题，来自加州大学洛杉矶分校（University of California, Los Angeles）的Yun-Tao Liu、Hongcheng Fan、Jason J. Hu和Z. Hong Zhou提出了一种全新的计算方法。他们开发了一款基于“自监督深度学习”的工具SPISONet（Single-Particle IsoNet），能够在不改变样品制备流程的情况下，通过计算方式针对性地解决优选取向相关的各向异性问题。该研究发表于2025年1月的《Nature Methods》。
研究流程研究目的SPISONet的开发主要致力于解决优选取向问题带来的两大核心问题：1）重构过程中产生的各向异性；2）因各向异性导致的颗粒错位（Misalignment）。研究团队采用了深度学习网络及其新颖的自监督框架，提出了两个相互独立但又相辅相成的模块——各向异性校正模块（Anisotropy Correction Module）和错位校正模块（Misalignment Correction Module）。
工作流程和实验设计1. 各向异性校正模块该模块需要输入两个未经过滤的半图（Half-Maps）以及溶剂掩膜（Solvent Mask）。其核心流程包括：
- 3DFSC的计算：利用三维傅里叶壳相关（3DFSC）算法来准确评估方向分辨率的各向异性。在SPISONet中集成了高效的3DFSC计算方法，通过降低计算复杂度，显著减少运行时间。
- 深度学习网络训练：基于U-Net架构的神经网络是该模块的重要技术支撑。网络的训练依赖于四种损失函数，包括数据一致性损失（Consistency Loss）、旋转等变损失（Equivariance Loss）、以及两种基于Noise2Noise框架的损失函数。这些损失函数确保了在信息恢复过程中，网络既能填补欠采样区域的数据，又能避免过拟合及伪影的生成。
- 信息恢复及去噪：通过自监督学习，SPISONet能够对各向异性区域的图像完成密度的补偿和局部去噪，从而改善三维重构地图的质量。
人工模拟和真实数据测试表明，SPISONet的各向异性校正模块在处理中等和轻度优选取向问题时，能够显著改善重构图像质量，甚至在较极端条件下也能够部分缓解优选取向造成的结构损伤。
2. 错位校正模块在三维分子重构中，优选取向问题会导致错误的颗粒取向赋值，而这往往是重构伪影的根源之一。错位校正模块通过一个整合流程解决这一问题：
- 参考图的生成：使用用户提供的参考图（可能来源于倾斜采集数据或低分辨率的初始结构）。
- 自动化迭代校正：模块结合RELION的3D重构和SPISONet的各向异性校正算法，逐步优化颗粒的取向分布。同时，为了避免潜在的初始参考模型偏倚（Model Bias），该模块还允许用户选择低分辨模式，以保证对结果的控制。
- 统一的误差控制：通过多步迭代优化，模块能够显著减轻取向偏差导致的伪影。
在与标准的三维重构流程相比较时，SPISONet展示了显著的误差改正性能。在经过错位校正和各向异性结合应用后，多个案例中展现了清晰的二级结构密度，包括α螺旋的节距和氨基酸侧链。
数据集和实验证明1. β-半乳糖苷酶数据集实验

研究团队使用β-半乳糖苷酶的Cryo-EM数据（RELION教程的数据集），通过挑选不同取向的颗粒（从2D分类中获得）来验证模块的有效性。结果显示，SPISONet成功改善了侧视图和顶视图颗粒所重建的各向异性地图，使得重构图中的二级结构密度更为完整。
2. 血凝素三聚体倾斜数据集

团队对40°倾斜采集的数据（EMPIAR-10097）进行了测试。经过SPISONet处理后，重构图分辨率提升至4.1Å，并修正了原图中不可见的侧链区域。此外，错位校正模块成功提高了图像各向同性，解除了原始数据中的方向分布偏差限制。
3. 严重优选取向的血凝素三聚体未倾斜数据

对于一个严重优选取向问题的数据集（EMPIAR-10096），SPISONet结合错位校正和各向异性校正，最终生成3.5Å分辨率的重构图。令人瞩目的是，这一方法成功解决了传统方法难以克服的重构伪影。
4. 病原性70S核糖体数据集

该实验对Acinetobacter baumannii 70S核糖体数据集中经过筛选的优选取向颗粒进行了处理。在使用不同低分辨率参考（70S或80S核糖体）作为基础的测试中，SPISONet均能生成优质重构图，进一步证明了其灵活性和适用性。
5. HIV病毒样粒子（VLP）

在HIV VLP亚颗粒平均化实验中，SPISONet生成的3.6Å分辨率的结构显示，优化后的图像各项指标均显著优于标准管线，体现了其在原位生物结构研究中的价值。
研究结果与总结SPISONet通过深度学习和自监督框架，不仅有效解决了优选取向问题，还为冷冻电镜重构任务提供了一个高效且通用的计算解决方案。它的主要优势包括：
1. 工作流纯计算化：可极大简化制样流程，减少人为干预。
2. 对极端数据表现优异：即使在严重优选取向数据集中也能取得高质量结构。
3. 灵活性和泛用性：支持多种生物分子的分析，适用于单颗粒Cryo-EM和亚颗粒平均化方法。
这种创新性的计算工具不仅扩展了Cryo-EM在复杂生物样品研究中的适用性，还为高通量和高精度的结构解析铺平了道路。