Grepore-seq : un flux de travail robuste pour détecter les changements post-édition génique par PCR à longue portée et séquençage nanopore

Contexte de la recherche

Le système CRISPR/Cas9, en tant que système d’endonucléase ADN guidé par ARN, a été largement utilisé dans l’édition génomique. Avec l’augmentation continue de son potentiel dans les traitements cliniques, une évaluation complète des résultats de l’édition génique est devenue particulièrement importante. Cependant, il manque actuellement une méthode à grande échelle, économique et de nature pipeline pour détecter les résultats de l’édition génique, en particulier dans les cas d’insertion ou de délétion de grands fragments. Des études ont montré que des effets non ciblés peuvent survenir après l’édition par CRISPR/Cas9, tels que des délétions de grands fragments et des réarrangements génomiques complexes, ce qui pose des défis pour son application clinique.

Objectifs et innovation de la recherche

Pour résoudre les problèmes susmentionnés, cette étude introduit un nouveau flux de travail appelé “grepore-seq”, qui combine la PCR à longue portée et le séquençage nanopore pour détecter efficacement et précisément divers changements génétiques après l’édition par CRISPR/Cas9. En raison du taux d’erreur relativement élevé du séquençage Oxford Nanopore, les chercheurs ont développé un nouveau pipeline qui capture les séquences codées par des codes-barres en greppant les séquences de lecture des amplicons nanopores. Ce flux de travail, nommé Grepsseq, peut évaluer divers changements génétiques post-édition CRISPR/Cas9, tels que l’insertion de dsODN médiée par NHEJ et l’insertion de grands fragments médiée par HDR, et montre une bonne cohérence avec les résultats du séquençage de nouvelle génération Illumina.

Source de la recherche

Cette étude a été réalisée conjointement par Zi-Jun Quan, Si-Ang Li, Zhi-Xue Yang, Juan-Juan Zhao et al., principalement issus de l’équipe de recherche de l’Hôpital d’hématologie de l’Académie chinoise des sciences médicales. L’article a été publié dans la revue “Genomics Proteomics Bioinformatics” en 2023.

Processus de recherche

Sujets de recherche et traitement des échantillons

L’étude a d’abord procédé à l’édition génique de cellules K562, de cellules T humaines, de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques et de cellules souches pluripotentes induites. Les éditeurs RNP ont été injectés dans ces cellules par électroporation. Trois à quatre jours plus tard, l’ADN génomique a été extrait et une PCR à longue portée a été effectuée pour capturer des fragments de 4 à 8 kb autour des sites cibles de l’ARN guide. Des amorces avec codes-barres ont été ajoutées à l’extrémité 5’ des amorces sens pour faciliter le séquençage groupé des longs amplicons.

Partie expérimentale et analyse des données

1. Optimisation de la PCR : En comparant l’ADN polymérase KAPA HiFi, le kit de PCR pour longs amplicons NileHifi et l’ADN polymérase PrimeSTAR GXL, l’étude a révélé que PrimeSTAR offrait les meilleures performances en termes de spécificité et de rendement. Par conséquent, PrimeSTAR a été utilisé pour la PCR à longue portée dans les expériences ultérieures.
2. Traitement et analyse des données : Guppy a été utilisé pour le traitement initial des données et le découpage des fragments d’adaptateurs. Ensuite, Porechop a été utilisé pour tronquer les séquences terminales, et Minimap2 pour aligner les séquences lues avec les séquences de référence. Enfin, les fichiers BAM générés ont été visualisés avec IGV, et des scripts personnalisés ont été utilisés pour analyser les résultats de l’édition génique après insertion de dsODN, insertion HDR, insertion du squelette plasmidique ou délétion de grands fragments.

Validation de la fiabilité des données

L’étude a comparé les résultats du séquençage Illumina et de grepore-seq pour vérifier la précision de grepore-seq dans la détection d’insertions de petits fragments. Les résultats ont montré que grepore-seq pouvait détecter efficacement et précisément l’insertion de dsODN de 29 pb et l’insertion de grands fragments médiée par HDR, et présentait une forte corrélation avec les résultats du séquençage Illumina.

Résultats de la recherche

Principaux résultats

1. Extraction efficace des séquences lues par PCR à longue portée : L’étude a optimisé les conditions de PCR et a réussi à amplifier des fragments de 4 à 8 kb en utilisant l’ADN polymérase PrimeSTAR GXL.
2. Intégrité et précision des séquences lues : En combinant Guppy et Porechop pour le traitement des données de découpage, l’étude a constaté que la distribution de la longueur des séquences lues traitées était plus concentrée, réduisant ainsi le taux d’erreur.
3. Effet de démultiplexage des codes-barres : grepore-seq a montré un taux de récupération des données plus élevé et un taux de faux positifs plus faible par rapport à Barcode_splitter lors du traitement de longs amplicons avec plusieurs codes-barres.
4. Détection de l’insertion de grands fragments médiée par HDR : En utilisant un plasmide donneur à double coupure chevauchant le site cible CRISPR pour l’édition HDR, grepore-seq a réussi à détecter l’insertion HDR de fragments plus longs et a montré une excellente corrélation linéaire avec les résultats de l’analyse FACS.
5. Détection de l’insertion du squelette plasmidique : L’étude a révélé une certaine proportion d’insertions du squelette plasmidique et a vérifié le rôle de la voie NHEJ dans l’insertion du squelette plasmidique par des expériences d’inhibition de NHEJ.

Conclusions et signification de la recherche

1. Signification scientifique : Cette étude a établi un flux de travail efficace et précis pour évaluer divers changements génomiques après l’édition par CRISPR/Cas9. grepore-seq excelle non seulement dans le traitement et l’analyse des données, mais peut également résoudre efficacement les problèmes de détection des insertions et délétions de grands fragments, difficiles à détecter avec les technologies existantes.
2. Valeur d’application : Ce flux de travail présente des avantages économiques et d’échelle, pouvant être appliqué à l’évaluation rapide et à grande échelle de divers changements génomiques après édition génique. Cela fournit un nouveau moyen technique pour la recherche sur l’édition génique et les applications cliniques.

Points forts de la recherche

1. Innovation du flux de travail : Combinaison de la PCR à longue portée et du séquençage nanopore, développement d’un nouveau pipeline de traitement des données grepore-seq.
2. Précision des données : Assure une haute précision et un faible taux d’erreur des données grâce à diverses solutions et étapes d’optimisation.
3. Exhaustivité : Peut détecter divers changements génétiques médiés par CRISPR/Cas9, y compris les insertions de petits fragments, les insertions de grands fragments, les insertions du squelette plasmidique et les délétions de grands fragments.

Conclusion

grepore-seq fournit une méthode robuste et efficace pour détecter les changements génétiques après l’édition génique par CRISPR/Cas9. Ce flux de travail est non seulement adapté aux expériences de recherche scientifique, mais jette également les bases techniques pour les futures applications cliniques.