Un microscope biphotonique et triphotonique à grand champ de vision et résolution cellulaire unique pour l'imagerie en profondeur et étendue
Microscope à deux et trois photons avec grand champ de vision et résolution unicellulaire pour l’imagerie profonde et étendue
Contexte de recherche et problématique
La microscopie multiphotonique (Multiphoton Microscopy, MPM) est un outil puissant pour l’imagerie des tissus profonds, notamment dans l’étude du fonctionnement cérébral in vivo. Cependant, bien que la microscopie à deux photons (Two-Photon Microscopy, 2PM) puisse atteindre un large champ de vision (Field of View, FOV), sa profondeur d’imagerie reste généralement limitée aux régions corticales superficielles, ne permettant pas d’atteindre les structures plus profondes du cerveau. La microscopie à trois photons (Three-Photon Microscopy, 3PM), bien qu’elle puisse atteindre des profondeurs plus grandes, est limitée par des taux de répétition laser bas dus au risque de dommages thermiques, ce qui réduit son champ de vision et son débit d’imagerie. Par conséquent, comment réaliser une imagerie à grand champ (Large Field of View, LFOV) tout en maintenant une haute résolution devient un problème crucial dans le domaine de la microscopie multiphotonique.
Pour résoudre ce problème, Aaron T. Mok et al. ont développé un nouveau système de microscopie multiphotonique appelé DeepScope, optimisant l’efficacité de génération de signaux fluorescents grâce à une série d’innovations technologiques, permettant ainsi une imagerie profonde à résolution unicellulaire sur un grand champ. Cette recherche vise à surmonter les limitations techniques des microscopes multiphotoniques traditionnels et à fournir de nouveaux outils pour l’étude des circuits neuronaux à l’échelle systémique.
Source de l’article et informations sur les auteurs
Cet article a été rédigé par Aaron T. Mok, Tianyu Wang, Chris Xu et autres chercheurs, dont le premier auteur Aaron T. Mok et l’auteur correspondant Chris Xu appartiennent tous deux à l’École de Physique Appliquée et Ingénierie de l’Université Cornell (School of Applied and Engineering Physics, Cornell University). Les autres auteurs proviennent d’institutions renommées telles que l’Université de Boston, Harvard et le MIT. L’article a été publié en 2024 dans la revue en libre accès eLight, sous le titre “A large field-of-view, single-cell-resolution two- and three-photon microscope for deep and wide imaging”.
Méthodologie et conception expérimentale
a) Processus de recherche et détails expérimentaux
1. Développement du système DeepScope
DeepScope est un microscope multiphotonique à balayage polygonal avec excitation double adaptative (Dual Excitation with Adaptive Excitation Polygon-Scanning Multiphoton Microscope). Ses innovations principales incluent : - Excitation adaptative (Adaptive Excitation) : Utilisation de modulateurs électro-optiques (Electro-Optic Modulators, EOMs) pour ajuster dynamiquement la puissance laser, réduisant ainsi la puissance dans les zones ombragées par les vaisseaux sanguins et augmentant la puissance effective dans les régions d’intérêt. - Schéma de balayage par faisceaux (Beamlet Scanning Scheme) : Un retard de ligne de faisceau divise une impulsion laser unique en deux faisceaux espacés d’environ 20 nanosecondes, augmentant efficacement le taux de répétition laser et la vitesse de balayage. - Scanner polygonal (Polygon Scanner) : Un scanner polygonal de grand diamètre (9,5 mm) atteint un taux de balayage linéaire allant jusqu’à 6 kHz, surpassant largement les scanners galvanométriques traditionnels.
2. Sujets expérimentaux et traitement des échantillons
Les recherches se sont principalement concentrées sur des souris transgéniques (Transgenic Mice) et des poissons-zèbres adultes (Adult Zebrafish). Pendant les expériences, les chercheurs ont pratiqué une craniotomie chronique chez les souris et utilisé l’indicateur calcique GCaMP6s pour marquer les neurones. Pour les poissons-zèbres, ceux-ci ont été anesthésiés et fixés avant d’être soumis à une imagerie cérébrale complète.
3. Étapes expérimentales et tests effectués
- Imagerie profonde du cerveau de souris : Le système DeepScope a permis d’effectuer une imagerie structurelle et fonctionnelle de la couche corticale 6 (Layer 6, L6) et de la région CA1 de l’hippocampe (Cornu Ammonis 1, CA1) chez la souris, validant ainsi ses capacités d’imagerie profonde.
- Imagerie simultanée à deux et trois photons : Une imagerie simultanée des régions corticales superficielles et profondes a été réalisée dans un même champ de vision, démontrant la polyvalence du système.
- Imagerie complète du cerveau de poisson-zèbre : Une imagerie complète du cerveau de poissons-zèbres adultes a également été réalisée pour valider les capacités d’imagerie étendue du système.
4. Algorithmes d’analyse des données
Les chercheurs ont développé un script de traitement d’images basé sur MATLAB pour séparer les signaux à deux et trois photons, combiné au logiciel Suite2P pour corriger les mouvements, segmenter les neurones et extraire les signaux fluorescents des données d’activité calcique.
b) Résultats principaux et analyse des données
1. Imagerie profonde du cerveau de souris
DeepScope a réussi à réaliser une imagerie avec un champ de vision de 3,5 mm de diamètre, couvrant les régions corticales les plus profondes du cerveau de souris. Les données expérimentales montrent que, à une profondeur de 600 micromètres, le système peut enregistrer l’activité spontanée de 917 neurones à une fréquence de 4 Hz. De plus, l’imagerie de la région CA1 de l’hippocampe a validé les capacités d’imagerie sous-corticale du système.
2. Imagerie simultanée à deux et trois photons
Les expériences ont montré que DeepScope peut enregistrer simultanément l’activité neuronale des régions corticales superficielles et profondes dans un même champ de vision. Par exemple, dans une plage de profondeur de 320 à 600 micromètres, le système a enregistré l’activité calcique de 4523 neurones à une fréquence de 11 Hz.
3. Imagerie complète du cerveau de poisson-zèbre
DeepScope a également démontré sa capacité à réaliser une imagerie structurelle complète du cerveau de poissons-zèbres adultes, avec une profondeur d’imagerie dépassant 1 millimètre et un champ de vision supérieur à 3 millimètres. Les résultats expérimentaux montrent clairement les noyaux marqués par GCaMP6s dans les régions du télencéphale, du tectum optique et du cervelet, ainsi que les signaux de génération harmonique du troisième ordre (Third Harmonic Generation, THG) des structures osseuses et des faisceaux de fibres.
c) Conclusions et valeur de la recherche
Le développement réussi de DeepScope apporte de nouvelles solutions à la microscopie multiphotonique, avec les contributions principales suivantes : - Valeur scientifique : Réalisation d’une imagerie profonde à résolution unicellulaire sur un grand champ, surmontant les limitations techniques des microscopes multiphotoniques traditionnels. - Valeur applicative : Applicable à divers domaines comme les neurosciences, l’immunologie et l’oncologie, fournissant des outils importants pour l’étude des circuits neuronaux systémiques et l’analyse de modèles de maladies.
d) Points forts de la recherche
- Innovation technologique : Les schémas d’excitation adaptative et de balayage par faisceaux améliorent considérablement l’efficacité de génération de signaux fluorescents.
- Polyvalence : Prise en charge de l’imagerie simultanée à deux et trois photons, répondant aux besoins de recherche dans différentes régions de profondeur.
- Capacité d’imagerie étendue : Première réalisation d’une imagerie structurale complète du cerveau de poissons-zèbres adultes à haute résolution.
e) Autres informations utiles
La conception simple et compacte de DeepScope permet une intégration facile dans les microscopes multiphotoniques existants, offrant une solution pratique pour les laboratoires de recherche biomédicale.
Conclusion et signification
La recherche d’Aaron T. Mok et al. non seulement résout les problèmes clés de la microscopie multiphotonique, mais fournit également des outils puissants pour les futures recherches en neurosciences. Le développement de DeepScope marque une nouvelle étape dans la microscopie multiphotonique, son innovation et sa praticité en faisant un résultat emblématique dans ce domaine.