实时评估线粒体ATP合成反应的新方法——MitoRaise

学术背景

线粒体是细胞内的能量工厂，主要通过氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）途径合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）。ATP是细胞能量的主要载体，其合成速率直接反映了线粒体的功能状态。然而，传统的ATP测量方法通常只能通过单点测量ATP水平或通过氧消耗率（oxygen consumption rate, OCR）间接评估线粒体功能，无法实时监测ATP合成的动态变化。特别是在癌症等疾病中，线粒体代谢的异常与疾病进展密切相关，因此开发一种能够实时监测线粒体ATP合成速率的方法具有重要意义。

为了解决这一问题，来自Sungkyunkwan University和Samsung Medical Center的研究团队开发了一种名为MitoRaise的新技术，旨在实时测量线粒体ATP合成速率，并探索其在疾病监测中的潜在应用价值。

论文来源

该研究由Eun Sol Chang、Kyoung Song、Ji-Young Song等作者共同完成，研究团队来自Sungkyunkwan University和Samsung Medical Center等多个机构。论文于2024年发表在Cancer & Metabolism期刊上，题为《Real-time assessment of relative mitochondrial ATP synthesis response against inhibiting and stimulating substrates (MitoRaise)》。

研究流程与结果

1. MitoRaise技术的开发与验证

MitoRaise技术的核心是通过实时监测ATP水平的变化来评估线粒体ATP合成速率。研究团队首先设计了一种基于荧光信号的实验流程，利用细胞膜通透剂（plasma membrane permeabilizer, PMP）使细胞膜通透化，从而允许底物进入细胞并与线粒体反应。具体步骤如下：

• 细胞膜通透化：使用5-10 nM的PMP处理细胞，确保细胞膜通透化，同时保持线粒体膜的完整性。通过台盼蓝染色验证细胞膜通透化程度，确保90%以上的细胞被通透化。
• ATP合成速率测量：将通透化的细胞接种到96孔板中，加入含有腺苷酸激酶抑制剂（AP5A）的线粒体测定缓冲液（MAS buffer），随后加入ADP和荧光底物（ATPlite溶液）。通过荧光信号的变化实时监测ATP水平的变化。
• 底物刺激与抑制：在测量基础ATP水平后，依次加入刺激底物（如谷氨酸和苹果酸）和抑制底物（如鱼藤酮和丙二酸），分别测量ATP合成速率的增加和减少。

研究团队通过一系列实验验证了MitoRaise技术的灵敏度和特异性。实验结果显示，MitoRaise能够准确测量不同条件下线粒体ATP合成速率的变化，包括不同数量的线粒体、不同细胞数量、线粒体受损细胞以及异质细胞混合物。

2. 细胞系中的线粒体功能分析

为了进一步评估MitoRaise技术的应用潜力，研究团队对多种乳腺癌细胞系和其他细胞系进行了全面的线粒体功能分析。实验结果显示，不同细胞系的总ATP水平、ATP合成速率（ASR）和线粒体DNA拷贝数（mtDNA-CN）存在显著差异。特别是，MCF7和BT-474等细胞系显示出较高的线粒体呼吸活性，而MDA-MB-231和BT-20等细胞系则表现出较高的糖酵解活性。

通过相关性分析，研究团队发现，某些细胞系（如MCF7和BT-474）的总ATP水平与底物诱导的ATP合成速率呈正相关，而其他细胞系（如MDA-MB-231和BT-20）则没有这种相关性。这表明，MitoRaise技术能够有效区分依赖氧化磷酸化和依赖糖酵解的细胞代谢类型。

3. 临床样本中的应用

研究团队还利用MitoRaise技术分析了来自19名乳腺癌患者和23名健康女性的外周血单核细胞（PBMCs）。结果显示，乳腺癌患者的PBMCs显示出较低的基础ATP水平、鱼藤酮反应、丙二酸反应和线粒体DNA拷贝数，而谷氨酸诱导的ATP合成速率显著高于健康对照组。这些结果表明，乳腺癌患者的线粒体代谢状态与健康人群存在显著差异。

此外，研究团队还发现，年龄与基础ATP水平、鱼藤酮反应、丙二酸反应和线粒体DNA拷贝数呈负相关，提示线粒体功能可能随着年龄的增长而下降。

结论与意义

MitoRaise技术通过实时监测ATP合成速率，提供了一种新的方法来评估线粒体功能。该技术不仅能够准确测量线粒体ATP合成的动态变化，还能够区分不同代谢类型的细胞，具有广泛的应用潜力。特别是在癌症、衰老、慢性疲劳综合征和2型糖尿病等疾病的线粒体代谢研究中，MitoRaise技术有望成为一种重要的工具。

研究亮点

• 实时监测：MitoRaise技术能够实时测量线粒体ATP合成速率，克服了传统方法的局限性。
• 高灵敏度与特异性：通过一系列验证实验，MitoRaise技术展示了其在多种条件下的高灵敏度和特异性。
• 临床应用潜力：在乳腺癌患者PBMCs中的应用表明，MitoRaise技术能够有效区分疾病状态下的线粒体代谢差异。

其他有价值的信息

研究团队还指出，MitoRaise技术的进一步优化需要结合氧消耗率的测量，以准确计算磷酸氧比（P/O ratio），从而更全面地评估线粒体功能。此外，未来的研究将招募更多不同年龄段的参与者，以进一步验证线粒体代谢状态与年龄和疾病的关系。

MitoRaise技术为线粒体研究提供了新的工具，有望在疾病诊断和治疗中发挥重要作用。