Les endocannabinoïdes sont libérés à la demande via des microvésicules extracellulaires

Contexte académique

Les endocannabinoïdes (endocannabinoids, ECBs) sont une classe de neurotransmetteurs lipidiques qui jouent un rôle clé dans les fonctions cérébrales en activant le récepteur cannabinoïde CB1. Contrairement aux neurotransmetteurs classiques, les mécanismes de stockage et de libération des ECBs n’ont pas été entièrement élucidés, ce qui a conduit à de grandes lacunes dans la compréhension de la régulation de ces signaux. En particulier, le mécanisme moléculaire de la libération et du transport du 2-arachidonoylglycérol (2-AG), l’un des principaux ECBs, reste incertain. Des études précédentes ont proposé un modèle de “production à la demande” selon lequel le 2-AG est synthétisé et libéré par les neurones en réponse à des stimuli spécifiques, mais ce modèle ne peut pas complètement expliquer comment le 2-AG est libéré des neurones ni comment il traverse la membrane cellulaire pour atteindre les cellules cibles.

Pour résoudre ce problème, les chercheurs ont développé un système expérimental combinant des capteurs fluorescents codés génétiquement, de l’électrophysiologie et des modèles mathématiques afin d’étudier la signalisation des endocannabinoïdes avec une précision temporelle élevée. Leurs découvertes proposent un nouveau modèle de “libération à la demande”, selon lequel la formation de microvésicules (microvesicles) est une étape clé dans la libération du 2-AG. Ce modèle non seulement élargit le modèle de “production à la demande”, mais réconcilie également les trois hypothèses précédemment proposées sur le transport des ECBs, offrant ainsi un nouveau cadre pour comprendre la signalisation des endocannabinoïdes.

Source de l’article

Cet article a été co-rédigé par Verena M. Straub, Benjamin Barti, Sebastian T. Tandar et al., issus de plusieurs institutions de recherche telles que Leiden University, Indiana University, Peking University, et publié le 20 février 2025 dans la revue PNAS (Proceedings of the National Academy of Sciences), sous le titre « The endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol is released and transported on demand via extracellular microvesicles ».

Processus de recherche

1. Développement du système expérimental

Les chercheurs ont développé un système bicellulaire basé sur le capteur fluorescent GRABECB2.0 pour étudier la libération et le transport du 2-AG. Ce système combine des cellules HEK293T exprimant GRABECB2.0 et des cellules neuronales (Neuro2A). Lorsque les cellules Neuro2A sont stimulées, le 2-AG libéré active le capteur GRABECB2.0 présent sur les cellules HEK293T voisines, permettant ainsi de surveiller en temps réel les changements dynamiques du 2-AG grâce aux variations du signal fluorescent.

2. Validation du capteur fluorescent

À l’aide de microscopie confocale et d’un lecteur de fluorescence en plaque, les chercheurs ont validé l’efficacité du capteur GRABECB2.0 dans la détection de la libération du 2-AG. Les expériences ont montré qu’en réponse à une stimulation par l’ATP, le signal fluorescent des cellules HEK293T augmentait significativement, tandis que le capteur mutant GRABECB2.0 ne réagissait pas. De plus, en ajoutant différents inhibiteurs, les chercheurs ont confirmé que la libération du 2-AG dépend de la régulation par la protéine kinase C (PKC), la diacylglycérol lipase (DAGL) et le facteur d’ADP ribosylation 6 (ARF6).

3. Isolement et caractérisation des microvésicules

Les chercheurs ont isolé des vésicules extracellulaires (extracellular vesicles, EVs) à partir du surnageant de culture des cellules Neuro2A et les ont caractérisées par analyse de suivi de nanoparticules (nanoparticle tracking analysis, NTA) et par protéomique. Les résultats montrent qu’une stimulation par ATP augmente significativement la libération des EVs, et que ces EVs contiennent du 2-AG, mais pas un autre ECB : l’anandamide. Chaque microvésicule contient environ 2000 molécules de 2-AG.

4. Expériences électrophysiologiques

Pour valider le rôle des microvésicules dans la signalisation neuronale, les chercheurs ont mené des expériences électrophysiologiques sur des tranches hippocampiques aiguës. Les résultats montrent que ARF6 et les inhibiteurs du transport des ECBs affectent significativement la plasticité synaptique induite par le 2-AG, renforçant ainsi l’importance des microvésicules dans la signalisation du 2-AG.

5. Construction d’un modèle mathématique

Pour décrire quantitativement la cinétique de libération du 2-AG, les chercheurs ont construit un modèle mathématique. Ce modèle prend en compte la production, le métabolisme, la distribution du 2-AG ainsi que la formation et la libération des microvésicules. Les résultats de l’ajustement du modèle montrent que la formation des microvésicules est l’étape limitante de la libération du 2-AG, et non sa production.

Résultats principaux

1. Efficacité du capteur GRABECB2.0 : Les expériences ont confirmé que le capteur GRABECB2.0 peut surveiller en temps réel la libération et le transport du 2-AG, et que les variations du signal sont significativement corrélées à la stimulation par l’ATP.
2. Libération des microvésicules et teneur en 2-AG : Une stimulation par ATP augmente significativement la libération des EVs, et ces EVs contiennent du 2-AG, mais pas d’anandamide. Chaque microvésicule contient environ 2000 molécules de 2-AG.
3. Rôle d’ARF6 et des inhibiteurs de transport des ECBs : ARF6 et les inhibiteurs du transport des ECBs affectent significativement la plasticité synaptique induite par le 2-AG, indiquant un rôle clé des microvésicules dans la signalisation du 2-AG.
4. Soutien du modèle mathématique : Le modèle mathématique montre que la formation des microvésicules est l’étape limitante de la libération du 2-AG, tandis que l’absorption du 2-AG est l’étape limitante globale pour l’activation du capteur.

Conclusion

Cette étude propose un nouveau modèle de “libération à la demande”, selon lequel la formation et la libération des microvésicules sont des étapes clés dans la signalisation du 2-AG. Ce modèle non seulement élargit le modèle de “production à la demande”, mais offre également un nouveau cadre pour comprendre les mécanismes moléculaires de la signalisation des endocannabinoïdes. Les résultats montrent que les microvésicules transportant le 2-AG jouent un rôle important dans la communication neuronale, en collaboration avec les vésicules synaptiques classiques pour réguler la transmission nerveuse.

Points forts de la recherche

1. Proposition d’un nouveau modèle : Cette étude propose pour la première fois un modèle de “libération à la demande”, offrant une nouvelle perspective pour comprendre la signalisation des endocannabinoïdes.
2. Innovation du système expérimental : En combinant des capteurs fluorescents codés génétiquement, de l’électrophysiologie et des modèles mathématiques, les chercheurs ont développé un système expérimental à haute précision temporelle capable de surveiller en temps réel les changements dynamiques du 2-AG.
3. Rôle des microvésicules : L’étude a révélé que les microvésicules sont des vecteurs importants pour la libération du 2-AG, chaque microvésicule contenant environ 2000 molécules de 2-AG.
4. Recherche interdisciplinaire : Cette étude combine biologie moléculaire, électrophysiologie et modélisation mathématique, montrant les avantages de la recherche interdisciplinaire pour résoudre des problèmes biologiques complexes.

Signification et valeur de la recherche

Cette étude approfondit non seulement la compréhension des mécanismes de signalisation des endocannabinoïdes, mais ouvre également de nouvelles perspectives pour le développement de médicaments ciblant le récepteur CB1. De plus, le modèle de “libération à la demande” proposé pourrait servir de référence pour d’autres recherches sur la signalisation lipidique. En révélant le rôle des microvésicules dans la communication neuronale, cette recherche offre de nouveaux cibles potentielles pour le traitement des maladies du système nerveux.

Autres informations utiles

1. Analyse protéomique : Les chercheurs ont analysé les protéines contenues dans les EVs à l’aide de techniques de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS), identifiant diverses protéines impliquées dans la libération et le transport du 2-AG, comme ARF6 et FABP5.
2. Paramètres détaillés du modèle mathématique : Le modèle estime la distribution et le taux de libération du 2-AG dans les microvésicules, fournissant ainsi un outil quantitatif pour des recherches futures.
3. Validation par des expériences électrophysiologiques : L’étude a validé le rôle des microvésicules dans la signalisation du 2-AG dans des tranches hippocampiques, montrant que ce mécanisme est également applicable dans des conditions physiologiques.

Cette recherche présente non seulement une grande valeur scientifique, mais ouvre également de nouvelles directions pour le développement futur de médicaments et le traitement des maladies du système nerveux.