DNAまたはRNAターゲット結合によって活性化されたCas9の転ヌクレアーゼ活性

本研究では、crRNAとtracrRNAによって指示され、DNAまたはRNAの標的の結合によって活性化される、「trans-cleavage」活性を持つ別のタイプの2型CRISPR-Casシステム、II型Cas9システムを実証しました。Cas9エフェクターヌクレアーゼのtrans-cleavage活性と核酸増幅技術を組み合わせることで、DACDおよびRACDと名付けた特異的なDNAおよびRNAサンプル検出プラットフォームを作成しました。

Cas9は、キメラsgRNAおよびノンキメラcrRNAとtracrRNAの指示の下で、顕著に異なるssDNA trans-cleavage活性を示しました。酵素動力学分析によると、crRNAおよびtracrRNAによって指示されるCas9 trans-cleavageの触媒効率は、キメラsgRNAによって指示されるCas9 trans-cleavageの触媒効率よりもはるかに高い。この違いは、SpyCas9-sgRNA-target DNA複合体とSpyCas9-crRNA-tracrRNA-target DNA複合体の異なる構造構成に関連している可能性があります。我々は、SpyCas9-sgRNA-target DNA複合体と比較して、SpyCas9-crRNA-tracrRNA-target DNA複合体がより均一な構造を持つことを観察しました。さらに、他のドメインのコンフォメーションがほぼ同じであるにもかかわらず、HNHドメインに顕著な違いがあることに気付きました。

Cas12aと同様に、Cas9もtrans-substrate切断の基質配列の好みを示しました。Cas9およびCas12aヌクレアーゼはともに、TまたはCに富むssDNA基質の分解を好む傾向があり、これはII型およびV型CRISPRエフェクタープロテインに共通の性質である可能性があります。我々は、Cas9介在のtrans-cleavageおよびcis-cleavageの基質配列の好みを検証しました。HNHドメイン依存のcis-cleavageが相補鎖に対して配列の好みを持たない可能性がある一方、Ruvcドメイン依存のcis-cleavageは非相補鎖に対して配列の好みを持ち、非特異的なssDNAのtrans-degradationと一致しています。これらの結果は、Ruvcドメイン依存のcis-cleavageおよびtrans-cleavageが類似の切断メカニズムを持つ可能性を示唆しています。

Cas9、Cas12a、およびCas13aのtrans-cleavage活性の詳細な比較は、それらが異なる基質結合親和性および異なる基質触媒効率を示すにもかかわらず、DNAおよびRNAターゲットオリゴヌクレオチドの増幅自由検出の限界において類似の検出限界を持つことを示しています。Cas12およびCas13aベースのプラットフォームと比較して、Cas9ベースの検出プラットフォームは幾つかの利点を持つ可能性があります。

全体として、我々の研究はCas9介在の核酸検出に新たな洞察を提供するとともに、遺伝子編集におけるCas9の応用に新たな考慮事項を提供します。我々の研究は、Cas9がin vitroでtrans-cleavage活性を持つことを確認しただけですが、in vivoでも遺伝子編集に影響を及ぼす可能性があることを否定できないため、CRISPR-Cas9を使用する際にこの活性が他の生物種の遺伝子編集に影響を及ぼすかどうかを確認するためにはさらなる研究が必要です。