高效且高度放大的核酸靶标成像技术在细胞和组织病理学样本中的应用

2025-01-27 Mon
在组织与临床研究中高效扩增核酸靶标信号的新平台：PSABER研究背景及相关知识自1960年代Pardue和Gall首次提出原位杂交（In Situ Hybridization，ISH）以来，这项技术因其能够在固定样本中直观地展示核酸靶标的空间分布而受到了广泛的研究和临床应用关注。ISH依赖目标RNA或DNA与补体探针的杂交反应，其结果可通过荧光显微镜或透射光显微镜进行分析。ISH技术广泛用于基因组DNA的定位、人类核型分析、单细胞RNA定量分析，以及核内染色体空间组织的研究。其中，荧光原位杂交技术（Fluorescent In Situ Hybridization，FISH）尤其得益于荧光显微镜的多重标记能力，从而实现了单样本中多种RNA转录物的可视化。
尽管ISH技术不断发展，但信号灵敏度的提高和适用性的扩展仍是一个核心挑战。尤其是在固定石蜡包埋组织切片（FFPE）等复杂样本中，信号放大技术至关重要。现有放大技术主要分为两类：基于组装的技术（如分支DNA信号放大、杂交链反应）和基于酶的技术（如辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)催化信号位点报告）。然而，这些方法通常存在难以操作、费用昂贵或难以与临床技术融合的缺陷。近年来，Kishi等人提出了SABER（Signal Amplification by Exchange Reaction）技术，在延伸探针后进行单链DNA串联结合位点设计。SABER技术虽然低成本、高灵敏，但其信号放大能力有限，对颜色检测的支持也有所欠缺。
为此，研究团队提出了基于SABER优化的“PSABER”（Peroxidase SABER）。该方法旨在克服信号灵敏度以及广泛应用性上的不足，通过结合HRP酶催化沉积的荧光光或色度底物实现信号的局部增强，并将作用扩展至病理组织学领域。
文章来源与作者信息本文由Sahar Attar、Valentino E. Browning、Mary Krebs等学者主导完成，作者主要来自于美国华盛顿大学的多个研究机构，包括Department of Genome Sciences、Institute of Stem Cell and Regenerative Medicine及Brotman Baty Institute for Precision Medicine等。论文发表于2025年1月的《Nature Methods》（Volume 22, Issue 156-165），DOI为：https://doi.org/10.1038/s41592-024-02512-2。
PSABER研究内容详细叙述实验流程设计与技术创新1. 实验工作流概述PSABER研究的核心是通过在原位的样本中构建一个串联的检测位点，用以绑定HRP连接的寡核苷酸探针，并催化荧光或色度底物的沉积。整个研究流程分为以下主要步骤：
探针扩展：研究团队借助主引物扩展反应方法（Primer Exchange Reaction，PER），将探针长时间延伸，直至形成包含特定重复序列的长串联形式寡核苷酸片段。
样本杂交：应用于固定细胞或FFPE样本的探针首先与目标DNA/RNA杂交。
HRP信号放大：通过杂交的探针结合HRP标记的寡核苷酸，并引入H2O2和显色底物以催化沉积荧光或色度信号。
信号放大调用与多重检测：通过溶液交换（Solution Exchange）与PSABER的扩展属性，实现高度多重化的检测。
2. 应用于方法的验证工作研究团队针对以下多种核酸靶标进行了实验：
1. 针对ADAMTS1 mRNA的原位RNA杂交。
2. 基因组范围α卫星重复序列的DNA杂交。
3. 单拷贝200kb人类染色体片段（Xp22.32 region）的检测。
4. FFPE人肾组织切片中的UMOD RNA及47S前核糖体RNA序列靶标检测。
3. 溶液交换多重检测研究利用溶液交换技术，验证PSABER能够支持分子靶标的多次染色。作者在固定细胞中用PSABER成功多轮次可视化了CBX5 RNA、7SK小核RNA及47S RNA序列的分布模式。
4. 光学系统兼容性实验进一步展示PSABER不仅限于荧光显微镜使用，甚至能在低数值孔径（Numerical Aperture）的成像系统如10倍或20倍物镜下清晰分辨信号。
实验结果与支持数据实验得出了以下关键结果：
1. 信号放大能力：相比传统FISH，PSABER在RNA检测上提供了约25倍的信号增强，而在延长反应和底物反应时间后，放大比例甚至进一步提升至70倍。
2. 适用性验证：实验在多种样本环境下证实了PSABER的鲁棒性，包括复杂的FFPE组织内区域特异RNA的高灵敏检测。
3. 多重影像明确性：数据显示即使采用较低成本的标准光学设备，PSABER的亮点信号仍具有足够的空间分辨率和分析可靠性。
研究意义与科学价值PSABER技术的广泛适用性表明其在基础科学研究和临床检测中均具有显著意义：
科学价值：通过显著提升固定组织样本信号强度，PSABER有效补全了ISH方法在复杂实验条件下的不足。其成本较低的优势和多重检测能力使其特别适用于资源受限的研究实验室和大规模临床病理检测。
临床价值：在FFPE组织样本的示例中，PSABER为RNA/DNA靶标的精准定位与高灵敏度检测提供了新的技术选择。这或将推动其在致病基因检测、癌症诊断及病理学中更广泛的应用。
最重要的研究亮点技术创新性：PSABER结合现有SABER技术，首次有效支持颜色检测（色度法）的扩展。
高度灵敏的信号增强：信号放大数倍至几十倍，使其适用于低灵敏度设备。
多重检测潜力：溶液交换流程实现了多次靶标染色，在有限显微通道内探测更多靶标。
成本效益显著：与高成本的商用ISH信号放大方法相比，PSABER提供了经济高效的解决方案。
PSABER技术通过显著提高核酸检测可靠性，并扩展ISH方法在固定样本中的应用范围，为未来研究与临床实践带来了巨大的潜力。这项研究不仅填补了现有技术的空白，同时以其可及性、灵活性和高效性为分子生物学及病理诊断领域开辟了新的应用方向。