人工動的RNA構造アンサンブルに基づく普遍的なRNAアプタマーセンシングタグの合理的設計

人工動的RNA構造アンサンブルに基づく普遍的なRNAアプタマーセンシングタグの合理的設計

学術的背景

RNA分子は、自然および合成生物学的システムにおいて多様な役割を果たしており、その機能は動的かつ特定の三次元構造に強く依存しています。RNAの二次構造および三次構造(ヘアピン、疑似結び目、多分岐接合など)は、RNAの機能を理解するための重要な「構築ブロック」です。しかし、既存のRNA構造研究の多くは静的な構造に基づいており、ほとんどのRNA媒介プロセスは構造変化を伴います。したがって、動的構造アンサンブルの記述は、RNAの進化的保存パターンを捉え、その拡張設計を支援することができます。近年、蛍光RNAアプタマー(fluorogenic RNA aptamer, FRAPT)は生物学的応用において顕著な進展を遂げていますが、その設計は動的構造アンサンブルに対する深い理解を欠いており、普遍的な設計原則が不足しています。これらの制限を克服するために、研究者たちは人工的な動的RNA構造アンサンブル「SSPepper」を開発し、これに基づいて普遍的な蛍光RNAバイオセンシングタグ「SSPepper-Apt」を設計しました。このタグは、小分子代謝物やタンパク質のリアルタイムイメージングに使用でき、CRISPR媒介のゲノムイメージングおよび遺伝子編集において優れた互換性を示します。

論文の出典

この論文は、Jianing HouPei GuoJunyan WangDa Han、およびWeihong Tanによって共同執筆され、著者らは上海交通大学医学院分子医学研究所および中国科学院杭州医学研究所に所属しています。論文は2024年12月20日にPNAS(Proceedings of the National Academy of Sciences)誌に掲載され、タイトルは《Artificial dynamic structure ensemble-guided rational design of a universal RNA aptamer–based sensing tag》です。

研究の流れ

1. 人工動的RNA構造アンサンブル「SSPepper」の設計と開発

普遍的なFRAPTセンサーを開発するために、研究者たちは明確な構造情報を持つ蛍光RNAアプタマー「Pepper」を基盤として選択しました。モチーフ変異を導入することで、研究者たちは動的構造アンサンブル「SSPepper」を作成し、そのエネルギーランドスケープは複雑な蛍光コンホメーションを含むように設計されました。具体的な設計手順は以下の通りです:

  1. 正しい二次構造の確立:Pepper-HBC複合体の高分解能構造に基づいて、人工的な動的構造アンサンブルの二次構造を確立しました。
  2. ループの安定性の調整:FRAPT(Pepper)の蛍光団結合領域は変更できないため、代表的なモチーフ(ヘリックスおよび頂点ループ)を選択し、蛍光コンホメーションの比率を調整しました。
  3. スリップステムの導入:スリップステムの長さを変更することで、さまざまな生細胞イメージングアプリケーションにおける適応性を高めました。

これらの手順を通じて、研究者たちはPepperを3つの領域に分解しました:キー調節ドメイン(青色)、駆動要素(黄色)、および未変更の配列(灰色)。キー調節ドメインは、HBC結合部位の構造変化を開始すると仮定され、Pepperの非保存的なP1ヘリックスは、異なる長さのスリップステムを持つように再設計されました。

2. SSPepper-Aptのin vitro特性評価

SSPepper-Aptの移植性、拡張性、および構成可能性を検証するために、研究者たちはさまざまなターゲット結合RNA要素のコア配列をSSPepper-Aptにシームレスに挿入しました。これには、テオフィリンアプタマー、GTPアプタマー、ATPアプタマー、グアニンリボスイッチ、SAM-IIIリボスイッチ、牛免疫不全ウイルスTatペプチド標的RNA、およびトロンビンアプタマーが含まれます。一連の実験を通じて、研究者たちはSSPepper-Aptがさまざまなターゲットに対して広範な動的操作範囲と優れた選択性を示すことを確認しました。

3. SSPepper-Aptの生細胞内応用

研究者たちはさらにSSPepper-Aptを生細胞内で応用し、テオフィリンおよびS-アデノシルメチオニン(SAM)の動的変化を監視し、ペプチドおよびタンパク質の局在を可視化することに成功しました。さらに、SSPepper-AptはCRISPR-Cas9システムにおいて優れた互換性を示し、遺伝子編集効率の予測に使用できることが示されました。

主な結果

  1. SSPepperの設計と開発:スリップステムと調節ループを導入することで、研究者たちは動的構造アンサンブル「SSPepper」を成功裏に作成し、ループの安定性を通じて蛍光コンホメーションの比率を微調整することができました。
  2. SSPepper-Aptのin vitro特性評価:SSPepper-Aptは、さまざまなターゲットに対して広範な動的操作範囲と優れた選択性を示し、小分子代謝物、ペプチド、およびタンパク質の検出に使用できることが確認されました。
  3. SSPepper-Aptの生細胞内応用:SSPepper-Aptは、生細胞内でテオフィリンおよびSAMの動的変化を監視し、ペプチドおよびタンパク質の局在を可視化することに成功しました。さらに、SSPepper-AptはCRISPR-Cas9システムにおいて優れた互換性を示し、遺伝子編集効率の予測に使用できることが示されました。

結論

人工的な動的RNA構造アンサンブル「SSPepper」の開発を通じて、研究者たちは普遍的な蛍光RNAバイオセンシングタグ「SSPepper-Apt」を成功裏に設計しました。このタグは、拡張性、移植性、構成可能性、および信頼性を備えており、小分子代謝物およびタンパク質のリアルタイムイメージングに使用でき、CRISPR媒介のゲノムイメージングおよび遺伝子編集において優れた互換性を示します。この研究は、機能性RNAシステムの構築に普遍的なアプローチを提供し、煩雑な配列組み合わせプロセスを回避し、合成生物学ツールの応用範囲を拡大します。

研究のハイライト

  1. 動的構造アンサンブルの設計:スリップステムと調節ループを導入することで、研究者たちは動的構造アンサンブル「SSPepper」を成功裏に作成し、ループの安定性を通じて蛍光コンホメーションの比率を微調整することができました。
  2. 普遍的なセンシングタグの開発:SSPepper-Aptは、広範な動的操作範囲と優れた選択性を備えており、小分子代謝物、ペプチド、およびタンパク質の検出に使用できます。
  3. 生細胞イメージングと遺伝子編集:SSPepper-Aptは、生細胞内でテオフィリンおよびSAMの動的変化を監視し、ペプチドおよびタンパク質の局在を可視化することに成功しました。さらに、SSPepper-AptはCRISPR-Cas9システムにおいて優れた互換性を示し、遺伝子編集効率の予測に使用できることが示されました。

研究の意義

この研究は、機能性RNAシステムの構築に普遍的なアプローチを提供し、煩雑な配列組み合わせプロセスを回避し、合成生物学ツールの応用範囲を拡大します。SSPepper-Aptは、基礎研究において重要な価値を持つだけでなく、細胞内代謝物のリアルタイム監視、タンパク質局在、および遺伝子編集効率の予測など、生物医学応用において広範な応用可能性を秘めています。