自己増幅RNAにおける修飾ヌクレオチドによる完全代替がインターフェロン応答を抑制し、効果を高める

遺伝学 バイオエンジニアリング 生命科学 細胞生物学
修飾ヌクレオチド 自己増幅RNA インターフェロン応答 タンパク質発現 ワクチン SARS-CoV-2

序論

新型コロナウイルスのパンデミックの影響で、mRNAワクチン技術は顕著な進展を遂げましたが、その短い半減期と高用量の要件が副作用と可用性の問題を引き起こしています。これらの課題を克服するために、自己増幅RNA（self-amplifying RNA, saRNA）が研究の焦点となっています。saRNAは、アルファウイルスから取得されたRNA依存性RNAポリメラーゼ（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）を利用して自己複製を行い、理論的には用量と注射頻度を減らすことでワクチンの効果と安全性を向上させることができます。しかし、saRNAの初期研究では、その強力なインターフェロン（Interferon, IFN）応答が抗原の発現を抑制し、ワクチンの効力を低下させることが示されました。本研究は、完全に修飾ヌクレオチドを代替することによってインターフェロン応答を抑え、saRNAの長時間のタンパク質発現とワクチンの保護効力を向上させることを目的としています。

研究背景

本研究チームはボストン大学の生物医学工学部、生物デザインセンター、ウイルス学、免疫学および微生物学部、国家新興感染症実験室、化学部に所属しています。主要著者Joshua E. McGee、Jack R. Kirschおよび他の共著者は、改良型ヌクレオチドがsaRNAに及ぼす顕著な利益を明らかにしたこの研究を《Nature Biotechnology》誌に発表しました。

研究プロセス

研究は主に以下のステップに分かれています：

  1. saRNAライブラリーの構築と合成：試験管内転写（in vitro transcription, IVT）を用いて、完全に修飾ヌクレオチドを代替した一連のsaRNA構築体を合成し、これらの構築体には機能評価のために蛍光タンパク質mCherryをコードしました。
  2. 試験管内トランスフェクションとスクリーニング：これらのsaRNA構築体を脂質体トランスフェクション法を用いてHEK293T細胞にトランスフェクションし、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡を使用してmCherryの発現レベルを検出しました。結果は、5-ヒドロキシメチルシチジン（5-hydroxymethylcytidine, hm5C）、5-メチルシチジン（5-methylcytidine, m5C）または5-メチルウリジン（5-methyluridine, m5U）を完全に代替した構築体が顕著に高いトランスフェクション効率を示したことを明らかにしました。
  3. タンパク質発現の評価：HEK293T、C2C12、Jurkat細胞にトランスフェクション実験を行い、結果はm5C saRNAがこれら三種の細胞系において野性型saRNAおよびn1-メチルシュードウリジン（n1-methylpseudouridine, n1mψ）mRNAを上回るタンパク質発現レベルを示しました。
  4. インターフェロン応答の解析：人の末梢血単核細胞（PBMCs）においてm5C saRNAがインターフェロンα（IFNα）およびインターフェロンβ（IFNβ）の発現を著しく抑制することを示す実験を行い、早期インターフェロン応答の抑制においてその有効性を証明しました。
  5. 体内実験：マウスモデルを用いてm5C saRNAのタンパク質発現レベルとワクチン効力を評価し、m5C saRNAが低用量で顕著な保護効果を提供し、n1mψ mRNAおよび野性型saRNAと比較して持続的な抗体応答を誘導することを示しました。

研究結果

試験管内トランスフェクションとスクリーニング

研究は、完全に修飾ヌクレオチドで代替されたsaRNAがHEK293T細胞において野性型saRNAおよびn1mψ mRNAを大幅に上回るトランスフェクション効率を持つことを明らかにしました。特にm5C saRNAのトランスフェクション効率は14倍上昇し、hm5Cおよびm5Uはそれぞれ10倍および8倍上昇しました。これらの結果はフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡の分析によってさらに検証されました。

タンパク質発現の評価

HEK293TおよびC2C12細胞において、m5C saRNAのタンパク質発現レベルはそれぞれ野性型saRNAの68倍および314倍であることが示されました。Jurkat細胞の実験では、低用量であってもm5C saRNAが顕著にタンパク質発現を向上させることが示されました。これらの結果は、m5C saRNAが試験管内モデルにおいて優れたタンパク質発現能力を持つことを示しています。

インターフェロン応答の解析

人のPBMCsを用いた実験は、m5C saRNAがIFNαおよびIFNβの発現を著しく抑制することを示しました。詳細には、m5C saRNAはIFNα1およびIFNβ1の発現をそれぞれ8.5倍および3倍減少させました。これは、m5C saRNAが早期インターフェロン応答を抑制する上で顕著な優位性を持ち、ワクチンの効力と安全性を向上させることを示しています。

体内実験

マウスモデルにおいて、m5C saRNAは長時間のタンパク質発現と顕著なワクチン保護効果を示しました。致死量のSARS-CoV-2ウイルスを接種したマウスは、高い生存率と顕著な抗体応答を示しました。特に低用量グループでは、m5C saRNAによって誘導された抗体の滴度が野性型saRNAおよびn1mψ mRNAよりも明らかに高く、その低用量での有効性が証明されました。

結論

この研究は、完全に修飾ヌクレオチドで代替されたsaRNAがインターフェロン応答を抑制し、タンパク質発現を強化し、低用量で効果的なワクチン保護を提供できることを示しています。この発見は、saRNAワクチンの効力と安全性の向上に寄与し、saRNAが遺伝子治療や他の応用においても可能性を秘めていることを示しています。

研究ハイライト

  1. 革新的なアプローチ：研究は、完全に修飾ヌクレオチドがsaRNAのトランスフェクション効率とタンパク質発現レベルを大幅に向上させることを初めて証明しました。
  2. 顕著なタンパク質発現：m5C saRNAは多種類の細胞系において優れたタンパク質発現能力を示し、特に低用量での発現効果が顕著です。
  3. インターフェロン応答の抑制：m5C saRNAは早期インターフェロン応答を効果的に抑制し、炎症反応を減少させ、ワクチンの安全性と効力を向上させます。
  4. 長期のワクチン保護：体内実験は、m5C saRNAが低用量で長期的なワクチン保護を提供し、強力な抗体応答を誘導することを示しています。

研究の価値

この研究は、特にワクチンおよび遺伝子治療分野におけるsaRNA技術の発展において重要な科学的証拠を提供します。インターフェロン応答を抑制し、タンパク質発現を強化することにより、修飾ヌクレオチドの応用はsaRNAワクチンの効力と安全性を向上させることが期待され、用量の減少と副作用の軽減に寄与し、saRNA技術の実際の応用において広く普及し発展する可能性が高まります。

未来の展望

将来の研究では、特に非ヒト霊長類および人類におけるm5C saRNAの臨床レベルでの安全性と効力をさらに評価します。加えて、他のRNA形式における修飾ヌクレオチドの互換性と相互作用も探求し、saRNA技術の可能性をさらに解明します。継続的な研究と革新を通じて、saRNAがワクチンおよび遺伝子治療分野において革命的な進展をもたらすことが期待されます。