使用长范围PCR和纳米孔测序检测基因编辑后变化的稳健工作流程
Grepore-seq：一种通过长范围PCR和纳米孔测序检测基因编辑后变化的稳健工作流程
研究背景
CRISPR/Cas9系统作为一种RNA指导的DNA内切酶系统，在基因组编辑中得到了广泛的应用。随着其在临床治疗中潜力的不断增加，全面评估基因编辑结果变得尤为重要。然而，目前缺乏一种大规模、经济高效且具有流水线性质的方法来检测基因编辑的结果，特别是插入或缺失大片段的情况。研究表明，CRISPR/Cas9编辑后可能出现非目标效果，如大片段删除和复杂的基因组重排，这对其临床应用提出了挑战。
研究目的和创新
为了解决上述问题，本研究引入了一种新型处理流程“grepore-seq”，其结合了长范围PCR和纳米孔测序，以高效且准确地检测CRISPR/Cas9编辑后的多种基因变化。由于Oxford Nanopore测序具有较高的错误率，研究人员开发了一种新型管道，通过grepping纳米孔扩增子的读取序列来捕获带条形码的序列。将该工作流程命名为Grepsseq，可以对CRISPR/Cas9编辑后的多种基因变化，如NHEJ介导的dsODN插入和HDR介导的大片段插入进行评价，并与Illumina下一代测序结果表现出较好的一致性。
研究来源
本文的研究由Zi-Jun Quan，Si-Ang Li，Zhi-Xue Yang，Juan-Juan Zhao等人共同完成，主要来自于中国医学科学院血液病医院的研究团队。论文于2023年发布在《Genomics Proteomics Bioinformatics》期刊上。
研究流程
研究对象及样本处理
研究首先对K562细胞，人T细胞，造血干/祖细胞和诱导多能干细胞进行了基因编辑。通过电穿孔法，将RNP编辑器注入这些细胞中。三至四天后，提取基因组DNA，并进行长范围PCR，以捕获指南RNA靶点周围的4–8 kb片段。在前向引物的5’端添加带有条形码的引物，以便于长扩增子的池化测序。
实验部分和数据分析
- PCR优化：通过对比KAPA HiFi DNA聚合酶、NileHifi长扩增子PCR试剂盒和PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，研究发现PrimeSTAR在特异性和产率上表现最佳。因此，后续实验均采用PrimeSTAR进行长范围PCR。
- 数据处理及分析：使用Guppy进行初始数据处理并剪切适配器片段。然后，通过Porechop截取末端的序列，使用Minimap2将读取的序列与参考序列比对。最终，生成的BAM文件使用IGV进行可视化，并采用自开发的脚本分析dsODN插入、HDR插入、质粒骨架插入或大片段缺失后的基因编辑结果。
数据可靠性验证
研究通过对比Illumina测序和grepore-seq的结果，以验证grepore-seq在检测短片段插入上的准确性。结果表明，grepore-seq可以有效地准确检测29 bp的dsODN插入与HDR介导的大片段插入，并与Illumina测序结果表现出高度的相关性。
研究结果
主要结果
- 长范围PCR读取序列的有效提取：研究优化了PCR条件，并使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶成功扩增了4–8 kb的片段。
- 读取序列的完整性和精确性：通过结合Guppy和Porechop进行数据剪切处理，研究发现处理后的读取序列长度分布更加集中，减少了错误率。
- 条形码解复用效果：grepore-seq在处理多个条形码的长扩增子时，相较于Barcode_splitter，表现出了更高的数据恢复率和更低的虚假发现率。
- HDR介导的大片段插入检测：使用叠加在CRISPR目标位点的双切割供体质粒进行HDR编辑，grepore-seq成功检测到较长片段的HDR插入，并与FACS分析结果表现出优秀的线性相关性。
- 质粒骨架插入的检测：研究揭示了一定比例的质粒骨架插入，并通过NHEJ抑制实验验证了NHEJ途径在质粒骨架插入中的作用。
研究结论和意义
- 科学意义: 本研究建立了一种高效且准确的流程，用于评估CRISPR/Cas9编辑后的多种基因组变化。grepore-seq不仅在数据处理和数据分析方面表现出色，还能有效解决现有技术难以检测的大片段插入和删除问题。
- 应用价值: 该流程具有经济性和规模优势，能够应用于基因编辑后各种基因组变化的快速、大规模评估。这对基因编辑研究和临床应用提供了新的技术手段。
研究亮点
- 流程创新：结合长范围PCR与纳米孔测序，开发了新的数据处理管道grepore-seq。
- 数据准确性：通过多种优化方案和步骤，确保数据的高精确度和低错误率。
- 全面性：可检测多种CRISPR/Cas9介导的基因变化，包括短片段插入、大片段插入、质粒骨架插入和大片段缺失。
结论
grepore-seq为CRISPR/Cas9基因编辑后的基因变化检测提供了一种稳健且高效的方法。此流程不仅适用于科研实验，也为未来的临床应用奠定了技术基础。