实验自身免疫性脑炎中脊髓组织源性细胞外囊泡的表征

引言

多发性硬化症(MS)是一种中枢神经系统(CNS)的慢性脱髓鞘疾病,目前其病因和预测疾病进展的方法仍在研究之中。实验性自身免疫性脑炎(EAE)是MS的小鼠模型,在该模型中,由佐剂活化的髓鞘反应性T细胞会攻击寡dendroglia细胞,导致脊髓和视神经前部出现神经炎症。

细胞外囊泡(EVs)是由所有细胞释放的一类膜包裹的颗粒,能够双向穿过血脑屏障。EVs在健康和疾病状态下具有多种功能,如细胞间通讯、物质转运和免疫调节。因此,EVs在MS和EAE研究中引起了极大关注,被视为潜在的血浆生物标记物和治疗载体。然而,目前对疾病相关的EVs在CNS中的变化了解甚少。为了解决这一空白,我们分析了在诱导EAE前以及诱导后的第16天和第25天,小鼠脊髓源性EVs在物理和蛋白质组成上的变化。

材料与方法

本研究使用雌性C57BL/6J小鼠,通过MOG33-55多肽佐剂免疫的方式诱导EAE模型。在第16天(EAE急性期)和第25天(EAE慢性期)时,分离收集小鼠脊髓组织,采用尺寸排阻层析chromatography(SEC)与超速离心相结合的方法纯化EVs。利用纳米粒子示踪分析(NTA)和透射电子显微镜(TEM)表征EVs的物理特性。使用18-plex钙钛质谱(TMT)分析技术,对EAE不同时期点的EVs蛋白质组进行分析,并采用多种生物信息学工具进行后续分析。

结果

EVs的物理性质

NTA和TEM分析显示,与正常小鼠相比,EAE小鼠脊髓源性EVs在粒子浓度、大小分布和形态上无明显差异。质谱分析检测到已知的EV标志蛋白(如CD81、CD9、CD63等)在EVs中富集,而细胞核、细胞质和大部分线粒体蛋白则被降解,说明所分离的颗粒确实为EVs。

EVs蛋白质组的变化

共鉴定到7010个蛋白质,其中2823个在EAE的任一时间点发生了差异表达。主成分分析结果显示,正常、急性期和慢性期EAE的EVs样本能够聚为三个独立的簇,说明EVs蛋白质组在疾病进程中发生动态变化。

与正常对照相比,在EAE急性期EVs中最显著上调的蛋白质与炎症反应相关,包括抗原呈递相关蛋白(H2-D1等)、免疫相关GTPase(IIGP1等)、补体级联蛋白(C3等)和toll样受体等。而下调的蛋白则包括髓鞘蛋白、微丝束形成相关蛋白和星形胶质细胞标志蛋白BTBD17等。慢性期EVs的变化趋势与急性期类似,但变化程度较小。

基因本体(GO)富集分析发现,在EAE的两个时间点,与免疫反应相关的通路均显著上调,而与ATP合成、神经递质调节和神经递质囊泡循环相关的通路则下调。线性模型分析进一步显示,与正常对照相比,EAE急性期EVs中免疫反应、补体级联、凝血级联和巨噬细胞吞噬相关通路蛋白上调;而与ATP合成和神经元功能相关的通路蛋白则下调。

EVs的免疫细胞来源

生物信息学工具预测分析显示,EAE小鼠脊髓EVs中贡献的免疫细胞类型发生了动态变化。诱导EAE后,EVs中的T细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞的相对贡献均有所增加。并且,EAE过程中EVs中的调节性T细胞相对减少,而激活的CD4记忆T细胞在慢性期显著增加。此外,EVs中反映促炎巨噬细胞标志物的蛋白在急性期上调而在慢性期下调,而反映替代激活巨噬细胞的蛋白则在慢性期上调。

髓鞘蛋白和神经元蛋白的变化

EAE过程中,EVs中的重要髓鞘蛋白如MBP、PLP等水平下降,反映了寡突胶质细胞的丢失。而周围神经系统的髓鞘蛋白MPZ、PMP2以及参与神经包被调控的蛋白PRX、MPP6、NAALAD2等则在慢性期上调,可能反映了临时性的Schwann细胞向脱髓鞘区域的迁移和重髓鞘化修复过程。

生物信息学工具分析预测EVs中来源于星形胶质细胞、小胶质细胞和成熟神经元的蛋白贡献均有所下降,而来源于小胶质细胞祖细胞和微神经胶质细胞的贡献则增加。验证性分析进一步显示,与稳态微神经胶质细胞相关的标志蛋白(如TMEM119、P2RY12)在EAE中下调,而炎症相关的微神经胶质细胞标志物则上调,反映了微神经胶质细胞向pro-inflammatory表型的转变。

与髓鞘改变相对应,与神经元成熟分化和突触通路相关的蛋白在EVs中也随EAE进展而下调,尤其是与抑制性突触相关的蛋白相较于兴奋性突触蛋白下调得更为显著。进一步分析显示,EVs中的前突触蛋白较后突触蛋白下调更明显。

与MS血浆EVs生物标记物的关联

既往研究发现,多发性硬化症患者的血浆EVs中存在一些炎症相关的潜在生物标记物。令人感兴趣的是,我们在本研究中也观察到了很多这些生物标记物在EAE小鼠脊髓EVs中的变化,如补体蛋白、T细胞相关蛋白(CD4等)、凝血级联蛋白(纤维蛋白原等)和Toll样受体及其辅助受体等,进一步支持了EVs在EAE和MS中发挥共同的病理作用。

讨论

本研究系统性地表征了EAE小鼠脊髓来源EVs在物理特性和蛋白质组成上的变化,为EVs在MS模型中的作用提供了新见解。我们发现EAE过程中EVs的蛋白质组发生动态变化,反映了CNS中的关键病理进程如局部炎症、去/重髓鞘化和突触病理,也暗示EVs可能参与调节这些进程。此外,我们还观察到之前在MS患者血浆中发现的一些炎症相关EV生物标记物在EAE小鼠脊髓EVs中也发生改变,说明EVs在EAE和MS中的病理过程可能存在共同性,且EVs的蛋白质组变化在CNS和外周循环中具有一定的重叠。

本研究为阐明EVs在MS/EAE发病机制中的作用提供了新的线索,也为将来EVs相关的生物标记物研究和靶向治疗奠定了基础。需要指出的是,EVs的分离纯化和分析依旧存在一定的技术挑战,后续研究还需进一步探索更精确的分析手段。此外,也有必要在未来的研究中进一步探讨特定细胞源性EVs的功能学意义。