原发性家族性脑钙化症患者中引入上游开放阅读框的变异

2024-08-06 Tue
研究背景及问题陈述原发性家族性脑钙化症（Primary Familial Brain Calcification, PFBC）是一种罕见的神经系统疾病，表现为基底神经节和其他脑区的微血管钙化。尽管目前已经确定了至少六个与PFBC相关的基因（包括SLC20A2、XPR1、PDGFB、PDGFRB、MYORG和JAM2），但仍有超过50%的患者的致病原因尚不明确。这些未解释的病例可能包含在已知基因的非编码区中的隐匿变异。
研究人员假设，5’非翻译区（untranslated region, UTR）中的变异可能会引入AUG密码子，从而启动mRNA的翻译，导致某些PFBC基因的功能丧失。为验证这一假设，研究团队对113名与PFBC相关的探针的外显子测序数据进行了重新注释，并发现了PDGFB基因5’UTR中的两个上游AUG引入变异。
论文来源及作者介绍这篇题为“Upstream open reading frame-introducing variants in patients with primary familial brain calcification”的文章由Anne Rovelet-Lecrux、Antoine Bonnevalle、Olivier Quenez等学者撰写，研究团队主要来自法国的Univ Rouen Normandie、INSERM U1245和CHU Rouen等机构。该论文发表在2024年的《European Journal of Human Genetics》上，文章的通信作者是Gaël Nicolas。
研究流程研究步骤及对象患者选择与外显子测序：
研究团队在法国进行了多中心的国家层面的患者招募，并进行了外显子测序。所选患者需满足以下标准：脑钙化程度超过年龄相关阈值，并且血液中的甲状旁腺激素、磷和钙含量正常。
数据重新注释及变异筛选：
使用5UTR和UTR注释工具对113份无已知致病变异的PFBC患者的外显子数据进行了重新注释，筛选出PDGFB基因5’UTR中的两个变异。
变异功能验证：

利用GFP报告基因系统评估变异对蛋白质表达的影响。发现两个变异显著减少了GFP蛋白的表达水平。
临床基因共分离性分析：
通过Sanger测序验证这些变异在PFBC患者家系中的遗传共分离性。
样本及实验方法样本： 113名无已知致病变异的PFBC患者。
测序覆盖率： 使用Agilent的v5、v5+UTR和v6+UTR捕获试剂盒进行测序，确保了所有感兴趣基因5’UTR区域的较高覆盖率。
报告基因系统：
用于体外实验的HEK293细胞转染了含有不同PDGFB 5’UTR变异的GFP质粒。
通过Western Blot和定量PCR分析GFP的表达水平。
主要结果发现两个致病变异c.-373C>G变异：
该变异在家系中表现出共分离性，并被预测为形成一个功能性上游开放阅读框（uORF），抑制了正常的PDGFB翻译。
c.-318C>T变异：
这是一个简单病例中被发现的变异，预测为导致一个重叠的帧移开放阅读框（oORF），同样对蛋白表达产生显著影响。
实验验证结果Western Blot和qPCR结果：
变异c.-373C>G和c.-318C>T在GFP系统中均显著降低了蛋白水平。
Western Blot显示，c.-318C>T变异导致了一个比预期更大的GFP蛋白，表明新的启动子AUG被有效利用。
结论及意义该研究表明，PDGFB基因5’UTR中的上游AUG引入变异是PFBC的一种潜在致病机制，这种机制通过引入功能性uORF和帧移oORF抑制了翻译或导致非功能性蛋白的生成。这为未解释的PFBC患者提供了新的诊断方向，强调了重新注释和检测非编码区变异的重要性。
研究亮点创新性假设： 提出了5’UTR变异引入AUG密码子导致PFBC的新机制。
实验验证： 通过GFP报告系统验证了变异的功能性影响，证实了其致病性。
临床应用价值： 为未解释的PFBC病例提供了新的致病基因筛查方向，提示医务人员不要忽视非编码区变异。
其它重要信息本文还强调了在进行全基因组测序之前，通过重新注释现有的外显子测序数据进行变异筛查的重要性。尽管较少的编码区变异可能存在显著致病性，但不常见的非编码区变异同样可能发挥重要作用。因此，未来的研究应进一步扩大样本量以确认其他PFBC基因中的潜在非编码区致病变异。