Phosphorylation de Piezo1 à un Résidu Unique, Sérine-1612, Régule sa Mécanosensibilité et sa Fonction de Mécanotransduction In Vivo
Contexte de la recherche
Les canaux cationiques mécanorécepteurs connus, Piezo1 et Piezo2, médiatisent le processus de transduction de forces mécaniques dans divers types cellulaires tels que les cellules endothéliales, les globules rouges, les ostéoblastes, les cellules myocardiques, etc. Piezo1 joue un rôle crucial particulièrement dans les cellules endothéliales en régulant le développement vasculaire, le tonus vasculaire et la régulation de la pression artérielle par la perception des forces de cisaillement induites par le flux sanguin. Cependant, bien que l’importance physiologique des canaux Piezo soit largement reconnue in vivo, la manière dont les canaux Piezo1 réalisent la régulation de leur sensibilité mécanique via des modifications post-transcriptionnelles restait obscure. Cette étude s’intéresse à la façon dont la régulation par phosphorylation de Piezo1 permet une régulation précise de sa sensibilité mécanique et de sa fonction de transduction.
Objectif de la recherche
L’objectif principal de cette étude est de révéler les sites de phosphorylation du canal Piezo1 et d’examiner comment cette phosphorylation influence la sensibilité mécanique de Piezo1, en particulier en explorant les mécanismes de régulation médiés par PKA et PKC sur la fonction de Piezo1. Grâce à une série d’expériences biochimiques, de biologie moléculaire et d’électrophysiologie chez la souris et in vitro, l’équipe de recherche a identifié des sites de phosphorylation clés de Piezo1 et vérifié leur fonction physiologique dans la régulation de la pression artérielle et de l’endurance physique.
Méthodes de recherche
Processus expérimental et techniques clés
Identification des sites de phosphorylation du canal Piezo1 : L’équipe de recherche a d’abord utilisé des méthodes biochimiques pour déterminer un site clé sur Piezo1, à savoir la sérine en position 1612 (S1612), comme cible principale de phosphorylation par PKA et PKC. Par des expériences de pull-down et des tests de kinase in vitro avec [γ-32P]-ATP, ils ont déterminé que la protéine Piezo1 est spécifiquement phosphorylée en présence de PKA ou PKC.
Effets électrophysiologiques de la phosphorylation de Piezo1 : Grâce à des tests électrophysiologiques in vitro sur le courant de membrane des cellules exprimant Piezo1 de souris, l’équipe de recherche a découvert que l’activation de PKA par 8-Br-cAMP augmente significativement la sensibilité mécanique du canal Piezo1 et ralentit considérablement la vitesse d’inactivation du canal. Les résultats montrent que Piezo1 après phosphorylation présente une plus grande sensibilité mécanique et une plus forte endurance.
Validation fonctionnelle du canal Piezo1 dans les cellules endothéliales : En utilisant des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) en culture primaire et des activateurs de PKA tels que 8-Br-cAMP et forskoline, il a été observé que l’activité électrophysiologique de Piezo1 est significativement renforcée. Cependant, des expériences de biotinylation et de western blot indiquent que l’activation de PKA n’augmente pas l’expression de Piezo1 à la membrane cellulaire.
Construction et validation fonctionnelle d’un modèle de souris avec édition génomique: Grâce à la technologie CRISPR-Cas9, un modèle de souris knock-in Piezo1-S1612A, dans lequel ce site est muté en une forme non phosphorylable, a été créé. Des analyses dans ces souris knock-in ont révélé une perte de phosphorylation et de fonction de Piezo1 due à la mutation, démontrant que la phosphorylation du site S1612 est essentielle pour la fonction physiologique du canal Piezo1 in vivo.
Données de recherche et résultats de soutien
Résultats électrophysiologiques: Après traitement par 8-Br-cAMP, le courant maximal du canal Piezo1 augmente significativement de 1534 pA à 4090 pA, et le temps d’inactivation passe de 23 ms à 69 ms, indiquant que l’activation de PKA par phosphorylation du site S1612 peut augmenter la sensibilité mécanique de Piezo1.
Expériences physiologiques chez la souris : Comparées aux souris normales, les souris knock-in Piezo1-S1612A présentent une augmentation significative de la pression artérielle nocturne et des performances médiocres lors des tests d’endurance physique, ce qui suggère que l’absence de phosphorylation au site S1612 affecte la régulation de la sensibilité mécanique du canal Piezo1, impactant ainsi la pression artérielle et la performance physique.
Conclusion de l’étude
Cette étude a révélé un site de phosphorylation critique de Piezo1, S1612, qui peut être régulé efficacement par phosphorylation par PKA et PKC pour moduler la sensibilité mécanique et les caractéristiques d’inactivation de Piezo1, ayant ainsi un impact physiologique significatif sur l’homéostasie de la pression artérielle et la performance physique. Cette découverte aide à comprendre le mécanisme complexe de régulation des canaux Piezo1 in vivo et offre potentiellement une cible pour le traitement des maladies vasculaires associées.
Signification de l’étude
Valeur scientifique : Elle clarifie pour la première fois le site de phosphorylation de Piezo1, complétant le réseau de régulation structure-fonction de Piezo1 et fournissant de nouvelles perspectives pour explorer le rôle physiologique de Piezo1 dans divers types cellulaires.
Valeur clinique potentielle : Étant donné que Piezo1 joue un rôle dans divers tissus tels que les vaisseaux sanguins, les nerfs et les os, ce mécanisme de phosphorylation pourrait devenir une nouvelle cible moléculaire pour le traitement de maladies connexes telles que l’hypertension, les maladies cardiovasculaires et l’ostéoporose.
Points forts de l’étude
Découverte du mécanisme de régulation du site de phosphorylation crucial S1612 de Piezo1: Par la phosphorylation modifiant la sensibilité mécanique du canal, elle offre une nouvelle perspective pour la régulation fonctionnelle de Piezo1.
Construction d’un modèle de souris knock-in Piezo1-S1612A utilisant l’édition génétique: Elle a vérifié le rôle crucial de la phosphorylation dans la fonction du canal Piezo1, fournissant un modèle unique pour l’exploration des fonctions physiologiques de Piezo1 in vivo.
Clarification du rôle de PKA et PKC dans la phosphorylation de Piezo1: Elle fournit une base scientifique pour le développement futur de médicaments ciblés.
Autres informations
L’étude utilise une approche multi-niveaux et multi-méthodes pour valider l’importance du site de phosphorylation S1612, avec une application réussie des techniques d’électrophysiologie, de protéomique et d’édition génomique, assurant une recherche de haute qualité. De plus, les données expérimentales et le code peuvent être fournis sur demande, avec des méthodes expérimentales détaillées, garantissant une transparence et une reproductibilité élevées de la recherche.
Cette étude démontre que le site de phosphorylation S1612 du canal Piezo1 joue un rôle crucial dans la régulation de la pression artérielle et de la performance physique. Cette découverte présente une importance pour comprendre les mécanismes de régulation physiologique des canaux mécanorécepteurs et pourrait offrir de nouvelles cibles pour le traitement de maladies associées, favorisant ainsi les progrès de la recherche dans le domaine de Piezo1.