Activation de CRISPR-dCas9 de TSG-6 dans les MSC module le contenu des vésicules extracellulaires dérivées des MSC et atténue les réponses inflammatoires dans les cellules du disque intervertébral humain in vitro
La dégénérescence discale intervertébrale (Intervertebral Disc Degeneration, IVDD) est l’une des principales causes de douleurs lombaires dans le monde, affectant gravement la qualité de vie des patients. La dégénérescence discale s’accompagne généralement d’une réaction inflammatoire, entraînant la dégradation de la matrice extracellulaire (Extracellular Matrix, ECM) et la destruction structurelle. Bien que la thérapie cellulaire (comme les cellules souches mésenchymateuses, Mesenchymal Stem Cells, MSCs) ait été explorée comme une nouvelle approche pour traiter la dégénérescence discale, le microenvironnement du disque dégénéré a un impact négatif sur la survie cellulaire et l’efficacité de la transplantation. Ces dernières années, les vésicules extracellulaires (Extracellular Vesicles, EVs) sécrétées par les cellules souches mésenchymateuses ont attiré une attention considérable en raison de leurs effets anti-inflammatoires et de réparation tissulaire. Cependant, l’efficacité thérapeutique des EVs est limitée par la variabilité des donneurs, l’hétérogénéité et une puissance insuffisante. Par conséquent, la manière d’améliorer le potentiel thérapeutique des EVs grâce à l’ingénierie génétique est devenue un sujet de recherche brûlant.
La technologie d’édition génétique CRISPR-Cas9 offre un outil puissant pour réguler l’expression des gènes. En combinant la Cas9 “morte” (dCas9) avec un domaine d’activation transcriptionnelle, les chercheurs peuvent activer l’expression de gènes spécifiques sans modifier la séquence d’ADN. Cette étude vise à activer le gène 6 stimulé par le facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor-Stimulated Gene 6, TSG-6) dans les cellules souches mésenchymateuses à l’aide de la technologie CRISPR-dCas9, et à évaluer l’activité biologique des EVs sécrétées par ces MSCs modifiées sur les cellules du disque intervertébral humain in vitro.
Source de l’article
Cette étude a été réalisée par une équipe de recherche du Rochester Institute of Technology, de la Georgetown University School of Medicine, de l’University of Rochester Medical Center, entre autres. Les auteurs principaux incluent Iker Martinez-Zalbidea, Gabbie Wagner, Karin Wuertz-Kozak, etc. L’article a été publié en ligne le 5 février 2025 dans la revue Cellular and Molecular Bioengineering, sous le titre “CRISPR-dCas9 Activation of TSG-6 in MSCs Modulates the Cargo of MSC-Derived Extracellular Vesicles and Attenuates Inflammatory Responses in Human Intervertebral Disc Cells In Vitro”.
Processus et résultats de la recherche
1. Culture des cellules souches mésenchymateuses et activation CRISPR
Les chercheurs ont utilisé une lignée de cellules souches mésenchymateuses humaines immortalisées dérivées du tissu adipeux (ASC52Telo) et ont activé le gène TSG-6 à l’aide du système d’activation synergique CRISPR (Synergistic Activation Mediator, SAM). Les étapes spécifiques incluent : - Culture cellulaire : Les cellules ASC52Telo ont été cultivées dans un milieu de base contenant 10 % de sérum fœtal de bovin, à une densité de 5000 cellules/cm². - Activation CRISPR : Trois ARN guides simples (sgRNA) différents ciblant la région promotrice de TSG-6 ont été utilisés, et le complexe d’activation transcriptionnelle dCas9-VP64 et MS2-p65-HSF1 a été introduit dans les cellules via un système lentiviral. Après sélection antibiotique, des MSCs activées par TSG-6 et un groupe témoin non ciblé (NTC) ont été obtenus.
2. Extraction et caractérisation des EVs
Les EVs ont été extraites des MSCs activées par TSG-6 et du groupe témoin non ciblé. Les étapes spécifiques incluent : - Extraction des EVs : Après 48 heures de culture cellulaire, le milieu conditionné a été collecté et les EVs ont été isolées par ultracentrifugation. - Caractérisation des EVs : La distribution de la taille des particules a été mesurée par analyse de suivi de nanoparticules (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA), la morphologie des EVs a été observée par microscopie électronique à transmission (Transmission Electron Microscopy, TEM), et les marqueurs des EVs (comme CD63, TSG101, etc.) ont été détectés par un test d’immuno-array.
Les résultats ont montré que les EVs extraites présentaient une morphologie typique en forme de coupe, avec une distribution de taille principalement entre 100 et 300 nm, et exprimaient plusieurs marqueurs d’EVs, indiquant la réussite de l’obtention d’EVs de haute qualité.
3. Impact de l’activation de TSG-6 sur le contenu des EVs
Par analyse protéomique quantitative, les chercheurs ont comparé la composition protéique des EVs des MSCs activées par TSG-6 et du groupe témoin non ciblé. Les résultats ont montré que l’expression de la protéine TSG-6 dans les EVs activées par TSG-6 était significativement plus élevée que dans le groupe témoin (log2 fold change = 5,72). De plus, des différences d’expression ont été observées pour 35 autres protéines, y compris des cytokines, des facteurs de croissance et des inhibiteurs de métalloprotéinases matricielles.
4. Effet anti-inflammatoire des EVs sur les cellules du disque intervertébral humain
Les chercheurs ont isolé des cellules de disque intervertébral dégénéré à partir de patients subissant une chirurgie de la colonne vertébrale et ont induit une réaction inflammatoire par l’IL-1β. Les EVs activées par TSG-6 et les EVs du groupe témoin non ciblé ont été co-traitées avec l’IL-1β sur les cellules du disque intervertébral, et l’effet sur l’expression des marqueurs inflammatoires (comme IL-8, COX-2) a été évalué.
Les résultats ont montré que les EVs activées par TSG-6 ont significativement réduit l’expression de l’IL-8 et de la COX-2, indiquant un effet anti-inflammatoire. Cependant, par rapport aux EVs du groupe témoin, les EVs activées par TSG-6 n’ont pas montré d’avantage significatif en termes d’effet anti-inflammatoire.
Conclusion et signification
Cette étude a réussi à activer le gène TSG-6 dans les cellules souches mésenchymateuses en utilisant la technologie CRISPR-dCas9 et a démontré que les EVs sécrétées par ces MSCs modifiées possèdent un potentiel anti-inflammatoire. Bien que les EVs activées par TSG-6 n’aient pas montré d’efficacité anti-inflammatoire significativement supérieure à celle du groupe témoin, cette recherche fournit une base expérimentale importante pour améliorer le potentiel thérapeutique des EVs grâce à l’ingénierie génétique. Les recherches futures pourraient explorer l’activation simultanée de plusieurs gènes ou l’optimisation du processus de production des EVs pour améliorer leur efficacité thérapeutique.
Points forts de la recherche
- Méthode innovante d’ingénierie génétique : Première utilisation de la technologie CRISPR-dCas9 pour la régulation génétique des EVs des cellules souches mésenchymateuses, offrant une nouvelle direction de recherche pour la thérapie par EVs.
- Caractérisation et validation fonctionnelle des EVs : Caractérisation complète des propriétés physiques et biologiques des EVs par diverses méthodes expérimentales, et validation de leur effet anti-inflammatoire.
- Potentiel d’application clinique : Cette étude fournit une thérapie potentielle par EVs d’ingénierie génétique pour des maladies inflammatoires comme la dégénérescence discale.
Autres informations utiles
Cette étude a également révélé, grâce à l’analyse protéomique, l’impact étendu de l’activation de TSG-6 sur le contenu des EVs, offrant une nouvelle perspective pour comprendre les mécanismes fonctionnels des EVs. De plus, l’équipe de recherche prévoit d’explorer davantage le potentiel d’application des EVs dans la modulation immunitaire et la réparation tissulaire à l’avenir.
Grâce à cette étude, nous voyons non seulement le potentiel énorme de l’ingénierie génétique dans la thérapie par EVs, mais nous disposons également d’une base expérimentale importante pour les applications cliniques futures. Nous espérons que les recherches dans ce domaine apporteront des avancées dans le traitement de nombreuses maladies inflammatoires et dégénératives.