综合单细胞多组学HIV潜伏逆转研究揭示病毒再活化的全新调控因子

该篇题为《integrated single-cell multiomic analysis of hiv latency reversal reveals novel regulators of viral reactivation》的论文，由Manickam Ashokkumar、Wenwen Mei等多位研究者共同完成，分别来自于美国北卡罗来纳大学教堂山分校（University of North Carolina at Chapel Hill）和德州农工大学（Texas A&M University）等多家机构，并于2024年6月20日提前发表在《Genomics, Proteomics & Bioinformatics》期刊上。

研究背景

尽管抗逆转录病毒疗法（antiretroviral therapy, ART）在控制人类免疫缺陷病毒（HIV）感染方面取得了巨大的成功，但HIV仍然无法被治愈，这主要归因于体内存在的一小部分潜伏感染细胞库。这些细胞库在治疗过程中逃脱了免疫系统的攻击，使病毒在治疗停止后能够迅速反弹。因此，了解HIV潜伏的机制对于开发根治HIV的疗法至关重要。

为了逆转HIV潜伏，研究人员通常会使用潜伏逆转剂（latency reversing agents, LRAs）来诱导病毒基因的表达，从而使潜伏的HIV被激活，继而被免疫系统清除。然而，现有的LRA方法效率低下，仅能逆转约10%的具复制能力的病毒。这主要是因为HIV基因表达受多层次的抑制机制以及细胞环境和前病毒整合位点的异质性影响。因此，需全面了解这些抑制机制，以开发更广泛的LRA策略。

研究目的与方法

在本研究中，科研团队采用了整合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和单细胞分析转座酶可接近染色质序列（single-cell assay for transposase-accessible chromatin with sequencing, scATAC-seq）的方法，旨在通过同时分析基因组和染色质的可接近性，来揭示HIV基因表达调控和潜伏逆转的机制。

研究主要包括以下几个步骤：

1. 实验设计与数据采集：
   • 研究在以HIV-gfp感染的Primary CD4+ T细胞和Jurkat细胞系2D10中，使用Vorinostat、iBET151和Prostratin三种LRA剂分别进行刺激。
   • 利用流式细胞术和单细胞多组学技术，分析每种处理后的细胞。
2. 数据处理与分析：
   • 通过scRNA-seq和scATAC-seq同源分析HIV-gfp感染的Primary CD4+ T细胞和Jurkat细胞系2D10，聚类分析产生的多组学数据。
   • 计算转录因子偏差分数，识别在LRA处理后表现出差异性表观遗传特征的转录因子。
3. 转录因子与病毒转录关联分析：
   • 通过机器学习方法，训练模型预测哪个转录因子与HIV基因表达关联。
4. 功能验证：
   • 利用shRNA和CRISPR技术，验证关键转录因子对HIV基因表达的调控作用。

研究结果

数据分析与初步发现

整合scRNA-seq和scATAC-seq分析，研究从约125,000个细胞中获得了高质量的染色体可及性和RNA数据：

1. 在不同条件下，利用降维方法发现原代CD4+ T细胞和2D10细胞在经过不同LRA处理后表现出显著的分离，表明每种LRA对细胞转录组的影响不同。
2. 对HIV转录的基因表达进行检测，发现LRA Vorinostat和Prostratin可显著上调病毒RNA的丰度，而iBET151效果甚微。这表明这些LRA在重新激活HIV基因方面的效果各不相同。

关键调控因子的识别

通过分析，研究团队识别了多个与HIV转录相关的细胞转录因子和染色质特征：

1. 在Jurkat细胞系2D10中，最显著相关的转录因子为GATA3（正相关）和CTCF（负相关）。
2. 在原代CD4+ T细胞中，发现CENPF（中间蛋白）、GAPDH（与活跃的细胞代谢和细胞分裂有关）以及BACH2（转录因子）等显著相关的基因。此外，检测到前病毒染色质的可及性与病毒基因表达的关联，也发现了多个具有显著调控作用的转录因子例如AP-1和NF-κB家族成员。
3. 利用机器学习方法对已获得的数据进行分析，结果表明，机器学习模型在预测细胞中HIV表达的效果显著。

功能验证

1. GATA3在HIV reactivation中的作用:
   • 利用shRNA技术，抑制GATA3基因表达，结果显示在刺激Prostratin后，病毒基因表达显著下降。
2. FOXP1在HIV reactivation中的作用:
   • 抑制FOXP1基因表达可导致病毒基因表达的激活。相反，过量表达FOXP1可以抑制病毒基因的表达。
3. 在原代CD4+ T细胞中，同样通过CRISPR/Cas9技术敲除GATA3和FOXP1基因，处理过后使用Prostratin刺激，可见HIV的表现受到显著影响，验证了GATA3和FOXP1在HIV潜伏逆转中的重要调控作用。

结论与展望

研究结论

通过整合单细胞多组学技术，研究团队识别了一些具有潜在意义的HIV复活新调控因子，特别是转录因子GATA3和FOXP1。这些发现不仅在理论层面上丰富了对HIV潜伏及其逆转机制的理解，同时也为HIV治愈策略提供了新的潜在靶点。

应用价值

这些数据表明，基于单细胞分辨率的多组学方法能够有效揭示HIV基因表达调控的复杂网络，从而为开发更有效的LRA策略以及彻底消除HIV潜伏库提供了重要的科学依据。

科研亮点

• 创新的多组学分析方法：综合利用scRNA-seq和scATAC-seq，同时捕捉单细胞的基因表达和染色质可及性，提供了一个全面的多组学视角。
• 机器学习辅助分析：利用机器学习技术，能够从高维数据中提取重要特征，提高对HIV潜伏逆转机制的预测准确性。
• 成功验证关键转录因子的作用：通过功能性验证，进一步确认了GATA3和FOXP1在HIV潜伏逆转中的关键作用。

研究意义

该研究为HIV潜伏机制的探索提供了新的研究范式，同时为开发更为广泛有效的LRA策略，向治愈HIV迈出了重要一步。未来，进一步详细分析和功能验证更多的HIV复活调控因子，有望为终结HIV提供更多的可能性。