结直肠癌肿瘤微环境的多模态成像研究：揭示空间异质性

学术背景

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其复杂性和异质性使得治疗和预后预测极具挑战性。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）在癌症的进展、转移和治疗反应中扮演着关键角色，尤其是细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）中的胶原蛋白（collagen）对肿瘤病理生理学的影响尤为显著。然而，传统的组织学、结肠镜检查和分子筛查等方法无法全面表征肿瘤组织的空间复杂性，如癌症蛋白质组、胶原蛋白结构和细胞核分布的相互作用。

为了更深入地理解结直肠癌的异质性，本研究提出了一种多模态成像策略，结合双光子激光扫描显微镜（Two-Photon Laser Scanning Microscopy, 2PLSM）、组织学和基质辅助激光解吸电离质谱成像（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry Imaging, MALDI-MSI），以揭示结直肠癌肿瘤微环境的空间异质性。该研究首次将胶原纤维的结构一致性与肿瘤组织的细胞核分布特征与肽段特征相关联，为结直肠癌的病理生理学提供了新的见解。

论文来源

本论文由来自德国马克斯·普朗克多学科科学研究所（Max Planck Institute for Multidisciplinary Sciences）、哥廷根大学医学中心病理学研究所（Institute of Pathology, University Medical Center Göttingen）和柏林健康研究所（Berlin Institute of Health）的研究团队共同完成。主要作者包括Bharti Arora、Ajinkya Kulkarni、Andrea M. Markus等。论文于2024年发表在《npj Imaging》期刊上。

研究流程

1. 样本收集与处理

研究纳入了14例结直肠癌患者的肿瘤组织样本，样本的解剖位置、肿瘤分期和形态学特征均进行了详细记录。所有样本均按照哥廷根大学医学中心伦理委员会的批准和规定进行收集和使用。

2. 无标记成像

使用双光子激光扫描显微镜（2PLSM）对组织切片进行成像，捕捉胶原纤维产生的二次谐波信号（Second Harmonic Generation, SHG）和组织的双光子激发自发荧光信号（Two-Photon Excitation Autofluorescence, 2PEF）。通过这些信号，研究人员能够在不使用外源性荧光染料的情况下，以亚微米分辨率可视化组织中的胶原纤维结构。

3. MALDI-MSI样本制备

组织样本经过固定和石蜡包埋后，切成5微米厚的切片，并安装在导电玻璃载玻片上。在2PLSM成像后，样本进行MALDI-MSI分析。样本经过脱蜡、抗原修复和胰蛋白酶消化后，进行MALDI-MSI成像。

4. MALDI-MSI成像

使用Bruker Daltonik GmbH的Rapiflex® MALDI TissueTyper®进行MALDI-MSI成像，检测范围为800-3200 m/z，每个点进行500次激光射击，采样率为1.25 GS/s，光栅宽度为50微米。

5. 蛋白质鉴定

通过纳米液相色谱电喷雾电离串联质谱（nano-LC-ESI-MS/MS）对相邻组织切片进行蛋白质鉴定。肽段通过C18柱分离，并使用质谱仪进行检测。肽段鉴定通过人类Swiss-Prot数据库进行搜索。

6. 组织学分析

在MALDI-MSI成像后，组织切片进行苏木精和伊红（H&E）染色，并使用全切片扫描仪进行扫描。H&E图像用于在QuPath软件中标注肿瘤区域。

7. 图像处理

从2PLSM图像中提取SHG信号，并进行纹理分析，生成胶原纤维一致性的热图。从H&E图像中分割细胞核，并生成细胞核分布的热图。这些热图用于进一步分析不同区域的蛋白质组特征。

主要结果

1. 左、右侧结直肠癌的蛋白质组特征差异

通过MALDI-MSI数据的单变量分析，研究人员发现左、右侧结直肠癌（LSCC和RSCC）肿瘤组织之间存在差异分布的肽段。共确定了520个m/z峰，其中203个m/z值对应83种蛋白质。通过接收者操作特征分析（ROC），确定了76个m/z值在LSCC和RSCC之间存在显著差异。

2. 高细胞核分布区域的蛋白质组特征

研究发现，高细胞核分布（HND）区域在LSCC和RSCC组织中占据的面积显著低于低细胞核分布（LND）区域。通过ROC分析，确定了14个m/z值在HND和LND区域之间存在显著差异，这些m/z值对应7种蛋白质。

3. 胶原纤维组织的蛋白质组特征

通过2PLSM分析，研究人员发现LSCC和RSCC肿瘤组织中混沌胶原区域的比例显著高于有序胶原区域。通过MALDI-MSI数据的ROC分析，确定了43个m/z值在LSCC和RSCC的混沌胶原区域之间存在显著差异，这些m/z值对应19种蛋白质。

结论

本研究开发了一种新的多模态成像方法，结合2PLSM、组织学和MALDI-MSI，能够表征结直肠癌肿瘤微环境的空间异质性。通过量化LSCC、RSCC和健康组织中的肽段和成像特征，研究揭示了肿瘤微环境的异质性，并区分了LSCC和RSCC中不同区域的肽段特征。该研究为理解结直肠癌的进展、转移和治疗反应提供了新的视角，并为未来开发新的治疗靶点奠定了基础。

研究亮点

1. 多模态成像策略：首次将2PLSM、组织学和MALDI-MSI结合，全面表征结直肠癌肿瘤微环境的空间异质性。
2. 蛋白质组特征差异：揭示了LSCC和RSCC肿瘤组织之间的蛋白质组特征差异，为个性化治疗提供了潜在靶点。
3. 胶原纤维结构的影响：研究发现胶原纤维的组织结构在肿瘤病理生理学中扮演重要角色，为未来研究提供了新的方向。

研究意义

该研究不仅为结直肠癌的病理生理学提供了新的见解，还为未来开发基于肿瘤微环境的个性化治疗策略奠定了基础。通过结合多种成像技术，研究人员能够更全面地理解肿瘤的异质性，从而为临床诊断和治疗提供更精确的指导。