反义寡核苷酸介导的MSH3抑制减少亨廷顿病iPSC衍生纹状体神经元中体细胞CAG重复扩增

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亨廷顿病 CAG重复扩增 反义寡核苷酸 iPSC衍生神经元 MSH3蛋白

ASO介导的MSH3抑制在亨廷顿病中的治疗潜力

学术背景

亨廷顿病（Huntington’s Disease, HD）是一种由亨廷顿基因（HTT）中CAG重复序列异常扩展所致的神经退行性疾病。这种扩展的CAG重复序列在体细胞中会随时间的推移进一步扩展，推动疾病的发作和进展。MSH3是一种DNA错配修复蛋白，它通过驱动CAG重复序列的体细胞扩展过程，影响HD的发病和进展。MSH3的功能丧失变异在人类中相对耐受，因此它被认为是一个潜在的治疗靶点。然而，目前对于MSH3抑制在HD中的具体作用机制及其治疗效果尚不十分明确。本研究旨在探索通过反义寡核苷酸（ASO）抑制MSH3表达是否能够有效减缓HD患者诱导多能干细胞（iPSC）来源的纹状体神经元中的CAG重复序列扩展，并评估其安全性。

论文来源

本论文由Emma L. Bunting等人撰写，团队成员来自多个研究机构，包括英国伦敦大学学院（UCL）神经疾病与痴呆研究所、剑桥大学、格拉斯哥大学以及美国Broad研究所等。论文于2025年2月12日发表在《Science Translational Medicine》期刊上，题为“Antisense oligonucleotide–mediated MSH3 suppression reduces somatic CAG repeat expansion in Huntington’s disease iPSC–derived striatal neurons”。

研究流程与结果

1. 研究设计与目标

研究的主要目标是评估ASO介导的MSH3抑制是否能够有效减缓HD患者iPSC来源的纹状体神经元中CAG重复序列的扩展，并探索其在HD治疗中的潜力。研究分为以下几个步骤：
- iPSC来源的纹状体神经元培养：使用携带125个CAG重复序列的HD患者iPSC分化为纹状体神经元，并进行培养。
- ASO设计与筛选：设计并筛选针对MSH3 mRNA的ASO，选择最有效的ASO进行后续实验。
- MSH3抑制效果评估：在不同剂量下评估ASO对MSH3表达的抑制效果，并检测其对CAG重复序列扩展的影响。
- 转录组分析：通过RNA测序（RNA-seq）评估MSH3抑制对神经元转录组的影响。
- 动物模型验证：构建表达人类MSH3基因的敲入小鼠模型，验证ASO在体内的治疗效果。

2. 实验步骤与结果

(1) iPSC来源的纹状体神经元培养

研究人员使用HD患者的iPSC分化为纹状体神经元，并通过免疫荧光染色验证了神经元的分化效率。结果显示，培养的神经元中约86%为神经元细胞（MAP2+），67%为纹状体神经元（FOXP1+），30%为中棘神经元（DARPP32+），证明了模型的可靠性。

(2) ASO设计与筛选

研究人员设计了约230个针对人类MSH3 mRNA的ASO，并通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）筛选出6个最有效的ASO。最终选择了名为MSH3 ASO-1的ASO进行后续实验，其在A-431细胞中表现出最强的MSH3抑制效果。

(3) MSH3抑制效果评估

在iPSC分化的纹状体神经元中，研究人员进行了ASO剂量依赖性实验。结果显示，MSH3 ASO-1能够剂量依赖性地抑制MSH3的表达，最高剂量（3 μM）下MSH3的表达降低了95%以上。同时，ASO处理显著减缓了CAG重复序列的扩展，最高剂量下几乎完全阻止了扩展。通过CRISPR-Cas9技术敲除MSH3的实验也验证了这一结果，MSH3缺失的神经元中CAG重复序列出现了收缩现象。

(4) 转录组分析

通过RNA-seq分析，研究人员发现MSH3 ASO-1处理后，神经元中MSH3的表达显著降低，但没有检测到DNA修复相关通路的功能失调。尽管ASO处理对部分基因表达产生了影响，但这些变化并未涉及关键的通路，表明MSH3抑制在神经元中是相对安全的。

(5) 动物模型验证

研究人员构建了表达人类MSH3基因的敲入小鼠模型，并通过脑室内注射（ICV）给予MSH3 ASO-1。结果显示，ASO处理显著降低了小鼠大脑和脊髓中MSH3的表达，且在多个脑区表现出相似的抑制效果。动物实验表明，ASO处理在小鼠中具有良好的耐受性，未观察到明显的毒副作用。

3. 结论与意义

本研究首次在人类iPSC来源的纹状体神经元中系统评估了ASO介导的MSH3抑制对CAG重复序列扩展的影响，并证明了其治疗HD的潜力。研究结果表明，MSH3抑制能够有效减缓甚至阻止CAG重复序列的扩展，且对神经元的转录组影响较小。此外，通过小鼠模型的验证，进一步证明了ASO在体内的可行性和安全性。这些发现为开发基于MSH3抑制的HD治疗策略提供了重要的实验依据。

4. 研究亮点

  • 创新性的治疗策略：通过ASO抑制MSH3表达，为HD的治疗提供了新的思路。
  • 全面的实验验证：从体外细胞模型到体内动物模型，研究系统地验证了MSH3抑制的效果和安全性。
  • 临床转化潜力：研究结果为未来开展HD的临床试验奠定了坚实的科学基础。
  • 多学科合作：研究团队结合了遗传学、分子生物学、神经科学等多个学科的优势，推动了研究的深入。

5. 其他有价值的信息

研究中开发的人类MSH3敲入小鼠模型为未来开发针对MSH3的治疗药物提供了重要的实验工具。此外，研究还发现MSH3抑制在缺乏FAN1（一种与HD发病年龄相关的基因）的神经元中同样有效，表明这一治疗策略可能适用于具有高风险基因变异的HD患者。

总结

本研究通过多层次的实验验证，系统地评估了ASO介导的MSH3抑制在HD治疗中的潜力，并为其临床应用提供了重要的科学依据。未来的研究将进一步探索这一治疗策略在患者中的实际效果，并优化ASO的设计以提高其疗效和安全性。