Eomesodermin在NK细胞发育过程中通过调控KLF2和T-bet的时空机制

一、研究背景

自然杀伤细胞（Natural Killer, NK）是免疫系统中重要的细胞，能够识别和杀灭肿瘤细胞及病原体感染的细胞。NK细胞的生成和发育依赖于一系列特异性受体的逐步获取，这一过程中受到多种转录因子的严格调控，包括T-box转录因子家族中的Eomesodermin（Eomes）和T-bet。然而，Eomes在NK细胞发育中的具体时空调控机制尚不清楚。

Eomes和T-bet是NK细胞发育和功能的重要调控因子。Eomes主要表达于未成熟的NK细胞，影响NK细胞的早期谱系分化，而T-bet在成熟的NK细胞中起主导作用。现有研究表明，Eomes和T-bet可能在不同的发育阶段发挥不同的作用，但具体的调控机制仍需进一步探讨。

二、论文来源

本文由Junming He、Donglin Chen、Wei Xiong、Xinlei Hou、Yuhe Quan、Meixiang Yang和Zhongjun Dong合作完成，分别来自安徽医科大学第一附属医院及临床免疫学研究所、清华大学医学院、暨南大学珠海转化医学研究所以及其他国内顶尖实验室。论文发表于《Cellular & Molecular Immunology》期刊，在线发表时间为2024年5月13日。

三、研究过程

1. 研究方法和流程

1.1 体内Eomes缺失模型的构建

研究通过建立Eomes缺失的小鼠模型，以研究Eomes对NK细胞发育的不同时期的影响。具体包括： - 利用CD122-Cre转基因小鼠构建在NK progenitor（NKP）阶段特异性缺失Eomes的小鼠（Eomes^f/f/CD122^Cre/+）。 - 利用NCR1-Cre转基因小鼠构建在成熟NK细胞阶段特异性缺失Eomes的小鼠（Eomes^f/f/NCR1^Cre/+）。

1.2 NK细胞的分选和分析

通过流式细胞术对不同发育阶段的NK细胞进行分选，并分析细胞分化、增殖以及受体表达情况。利用Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq)和RNA-seq技术，分析Eomes与目标基因（如Klf2和T-bet）在染色体上的结合位点及其对转录水平的影响。

1.3 病毒感染和骨髓重建实验

利用CRISPR技术，对Klf2的特定区域进行编辑，并利用逆转录病毒系统构建表达Klf2的小鼠模型，评价其在Eomes缺失条件下对NK细胞发育的补偿作用。

2. 主要结果及数据支持

2.1 Eomes在不同阶段对NK细胞发育的影响

研究发现，在NKP阶段缺失Eomes会导致NK细胞的成熟受阻，而在成熟NK细胞阶段缺失Eomes则会促进NK细胞的终末成熟。具体发现如下： - Eomes在NKP和CD27+CD11b-（CD27 SP）未成熟NK细胞中的高表达，而在CD27+CD11b+（DP）和CD27-CD11b+（CD11b SP）成熟NK细胞中的表达较低。 - 体内特异性缺失Eomes后，Eomes^f/f/CD122^Cre/+小鼠NK细胞的比例和绝对数量显著下降，CD3-NK1.1+ NK细胞在脾脏、骨髓等组织中的数量减少。 - Eomes缺失引起的NK细胞发育受阻现象主要体现在NKP向未成熟NK细胞过渡阶段。

2.2 Eomes调控Klf2在早期NK细胞发育中的作用

RNA-seq和ChIP-seq数据显示，Eomes通过直接结合Klf2的启动子区域调控其表达。Klf2缺失会导致NK细胞的发育障碍，与Eomes缺失的表型相似： - Clonal immune editing (CHIME)和CRISPR技术验证了Klf2的特定位点编辑后会产生类似Eomes缺失的表型效应。 - 荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示，Klf2在Eomes缺失的小鼠NK细胞中表达显著降低。

2.3 Eomes和T-bet在NK细胞终末成熟中的对立调控

在NK细胞的终末成熟阶段，Eomes和T-bet相互拮抗调控： - ChIP-seq数据显示，Eomes直接结合并抑制T-bet基因，而T-bet则通过调控下游效应因子Zeb2促进NK细胞的终末分化。 - 在Eomes^f/f/NCR1^Cre/+小鼠模型中，Eomes缺失导致NK细胞中T-bet和Zeb2的表达上调，反映了Eomes对T-bet抑制作用的解除。

3. 研究价值及意义

3.1 科学价值

本研究揭示了Eomes在NK细胞发育中的时空调控机制，通过两种遗传小鼠模型全面解析了Eomes对不同发育阶段的作用。这一发现填补了NK细胞发育过程中重要转录因子互作机制的空白。

3.2 应用价值

通过对Eomes调控NK细胞发育机制的深入理解，可以为免疫治疗以及NK细胞相关疾病的治疗提供新的思路。例如，干预Eomes-Klf2或Eomes-T-bet途径，可能成为促进NK细胞功能或扩增的方法。

3.3 研究亮点及创新性

• 使用了多种遗传学模型，包括CD122-Cre和NCR1-Cre转基因小鼠，以及CRISPR技术，详细解读了Eomes在不同发育阶段的功能。
• 通过结合ChIP-seq、RNA-seq等多种技术手段，系统分析了Eomes的直接靶点基因及其转录调控网络。

四、总结

通过本研究的深入分析，我们不仅揭示了Eomes在NK细胞发育过程中扮演的复杂和关键的角色，而且为免疫系统的发育和功能的研究提供了新的视角。Eomes和T-bet的时空调控及其相互作用机制，提示我们在未来的免疫治疗策略中可以探索新的靶点和方法，提高治疗的精确性和有效性。