研究报告：β-羟基丁酸盐改善葡萄糖剥夺的HMC3人类小胶质细胞的还原状态、细胞因子分泌和吞噬能力

引言

小胶质细胞是大脑中的常驻神经免疫细胞，占总神经胶质细胞的5-12%，具有很强的迁移、增殖和吞噬能力。例如，小胶质细胞通过吞噬脑实质中的凋亡细胞废物来维持健康的脑微环境。在中枢神经系统感染或损伤的情况下，小胶质细胞会迁移到损伤部位，吞噬侵入的病原体或死亡细胞的碎片，并通过释放炎症细胞因子、趋化因子和生长因子帮助受损组织恢复。尽管小胶质细胞表现出复杂的功能性多样性，但葡萄糖代谢的损害如何影响它们的功能尚不清楚。葡萄糖代谢障碍在几乎所有神经退行性疾病和精神疾病中都很常见，例如卒中、帕金森病、阿尔茨海默病、物质使用障碍、焦虑和抑郁等。糖尿病患者接受胰岛素治疗时也会暂时出现低血糖。了解葡萄糖剥夺对小胶质细胞功能的影响对于这些疾病的机制研究和治疗具有重要意义。

论文来源

本文由Anil Kumar Rana, Babita Bhatt和Mohit Kumar等撰写，分别来自于National Agri-Food Biotechnology Institute和Regional Centre for Biotechnology。本文发表于2024年的《Journal of Neuroimmune Pharmacology》上。DOI为10.1007/s11481-024-10139-5。

研究的工作流程

本文通过体外培养的人类小胶质细胞系HMC3，在葡萄糖剥夺条件下研究了其表型状态、还原状态、细胞因子的分泌和吞噬能力的变化。此外，研究还探讨了β-羟基丁酸盐（BHB）作为代谢补充对这些特性的恢复作用。

实验设计和方法

1. 细胞培养与处理：

   • HMC3细胞在高葡萄糖（25mM）的DMEM中培养，补充10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素和链霉素抗生素。
   • 达到80–90%的汇合度后，将细胞替换为新高葡萄糖DMEM培养24小时。葡萄糖剥夺和BHB补充实验使用无葡萄糖DMEM和无葡萄糖DMEM补充5mM BHB培养细胞24小时。

2. MTT试验：

   • MTT还原依赖于NAD(P)H依赖的氧化还原酶，是氧化磷酸化和戊糖磷酸途径活性的直接指标。实验通过检测细胞氧化磷酸化水平验证葡萄糖剥夺对细胞代谢活性的影响。

3. 亚硝酸盐水平测定：

   • 使用Griess试剂检测细胞在不同条件下的亚硝酸盐水平，以评估细胞的还原状态。

4. 细胞死亡试验：

   • 使用台盼蓝染色法研究细胞死亡情况。台盼蓝染色剂无法通过完整细胞膜被带负电染料排斥，但可进入有损伤的死亡细胞。

5. 超氧化物水平：

   • 使用二氢乙啶（DHE）染料检测细胞暴露于不同条件后的超氧化物水平，评估细胞的抗氧化应激状态。

6. 线粒体染色：

   • 使用MitoTracker™红色染料评估细胞的线粒体健康状况。

7. 定量PCR：

   • 用定量逆转录PCR（qPCR）分析基因的mRNA表达。

8. 酶联免疫吸附测定（ELISA）：

   • 用于定量检测HMC3细胞在正常和葡萄糖剥夺条件下分泌的TNF、IL-1β、IL-6和IL-10等细胞因子水平。

9. 吞噬试验：

   • 利用荧光标记乳胶珠作为吞噬底物，评估细胞在不同处理条件下的吞噬能力。

10. 蛋白质印迹（Western Blot）：

    • 检测HMC3细胞在正常和葡萄糖剥夺条件下Nox2、BDH1和SCOT等蛋白质的表达水平。

研究结果

1. 葡萄糖剥夺对能量代谢和还原状态的影响：

   • MTT试验结果显示，葡萄糖剥夺导致HMC3细胞的代谢活性显著降低（p＜0.0001），线粒体健康状况也受损（Mitotracker染色减少）。尽管细胞未出现死亡（台盼蓝染色），但整体能量代谢和氧化还原状态受损。
   • 细胞在葡萄糖剥夺条件下Nox2 mRNA表达升高（p=0.007），但蛋白质水平降低。此外，超氧化物和亚硝酸盐水平也显著降低，表明葡萄糖剥夺条件下细胞的抗氧化应激能力受损。

2. 葡萄糖剥夺对细胞因子分泌的影响：

   • qPCR分析显示，葡萄糖剥夺条件下IL-1β mRNA表达升高（p=0.0009），而TNF mRNA表达显著降低（p=0.0009）。IL-6 mRNA表达无明显变化。
   • ELISA结果进一步确认，葡萄糖剥夺条件下IL-1β和TNF的分泌减少，而IL-6和IL-10的分泌无显著变化。

3. 葡萄糖剥夺对吞噬能力的影响：

   • qPCR分析发现，葡萄糖剥夺条件下TREM2（p=0.016）和CD68（p=0.0006） mRNA表达均显著升高。然而，功能性吞噬实验（乳胶珠）显示葡萄糖剥夺显著降低了细胞的吞噬活性。

4. BHB补充的恢复作用：

   • BHB补充显著恢复了糖剥夺HMC3细胞的IL-1β分泌（p=0.0328）和吞噬活性（p=0.0261）。
   • 机制上，BHB补充增加了BDH1蛋白质表达（p=0.0423），但SCOT表达无显著变化。此外，BHB补充还改善了线粒体健康（MTT还原水平显著升高，p＜0.0001）。

结论

本研究表明，葡萄糖代谢障碍可能影响小胶质细胞的吞噬和神经免疫功能，进而加重神经系统疾病中的病理变化。补充酮体（如BHB）可作为替代能量来源，恢复葡萄糖剥夺条件下小胶质细胞的能量代谢、还原状态、细胞因子分泌和吞噬能力。因此，BHB可能作为潜在的代谢疗法用于改善这些病理状况。未来，进一步的研究需要在更复杂的体内环境中验证这些发现。

研究亮点

• 首次深入探讨了葡萄糖剥夺对人类HMC3小胶质细胞的能量代谢、还原状态、细胞因子分泌和吞噬能力的影响。
• 发现葡萄糖剥夺显著降低了小胶质细胞的代谢活性和抗氧化应激能力，且削弱了其细胞因子分泌和吞噬功能。
• 提出BHB补充作为替代能量来源，可有效恢复葡萄糖剥夺条件下小胶质细胞的功能。