統合された単細胞マルチオミクス解析がHIV潜伏の逆転の新しい調節因子を明らかにする

2024-08-13 Tue
単一細胞マルチオミクスによるHIV潜伏逆転研究で、ウイルス再活性化の新規調節因子を解明本論文「integrated single-cell multiomic analysis of hiv latency reversal reveals novel regulators of viral reactivation」は、Manickam Ashokkumar、Wenwen Meiらの研究者グループによって執筆され、ノースカロライナ大学チャペルヒル校（University of North Carolina at Chapel Hill）やテキサスA&M大学（Texas A&M University）などの複数の機関から参加しています。2024年6月20日に「Genomics, Proteomics & Bioinformatics」誌に先行公開されました。
研究背景抗レトロウイルス療法（antiretroviral therapy, ART）がHIV感染の制御に大きな成功を収めているにもかかわらず、HIVは依然として治癒不可能です。これは主に、体内に存在する少数の潜伏感染細胞プールが原因です。これらの細胞プールは治療中に免疫系の攻撃を逃れ、治療中止後にウイルスが急速に反発することを可能にします。したがって、HIV潜伏のメカニズムを理解することは、HIVを根治する治療法の開発に不可欠です。
HIV潜伏を逆転させるために、研究者は通常、潜伏逆転剤（latency reversing agents, LRAs）を使用してウイルス遺伝子の発現を誘導し、潜伏HIVを活性化して免疫系によって排除されるようにします。しかし、既存のLRA方法の効率は低く、複製能力のあるウイルスの約10%しか逆転できません。これは主に、HIV遺伝子発現が多層の抑制メカニズム、細胞環境、およびプロウイルス挿入部位の異質性の影響を受けるためです。したがって、より広範なLRA戦略を開発するためには、これらの抑制メカニズムを包括的に理解する必要があります。
研究目的と方法本研究では、研究チームは単一細胞RNA-seq（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）と単一細胞ATAC-seq（single-cell assay for transposase-accessible chromatin with sequencing, scATAC-seq）を統合したアプローチを採用し、ゲノムとクロマチンのアクセス可能性を同時に分析することで、HIV遺伝子発現制御と潜伏逆転のメカニズムを明らかにすることを目指しました。
研究は主に以下のステップを含みます：
実験デザインとデータ収集：
HIV-gfp感染のPrimary CD4+ T細胞とJurkat細胞株2D10において、Vorinostat、iBET151、Prostratinの3種類のLRAを用いて刺激を行いました。
フローサイトメトリーと単一細胞マルチオミクス技術を用いて、各処理後の細胞を分析しました。
データ処理と分析：
scRNA-seqとscATAC-seqを用いてHIV-gfp感染のPrimary CD4+ T細胞とJurkat細胞株2D10のホモログ分析を行い、生成されたマルチオミクスデータをクラスター分析しました。
転写因子バイアススコアを計算し、LRA処理後に差異のあるエピジェネティック特徴を示す転写因子を特定しました。
転写因子とウイルス転写の関連性分析：
機械学習手法を用いて、どの転写因子がHIV遺伝子発現と関連しているかを予測するモデルを訓練しました。
機能検証：
shRNAとCRISPR技術を用いて、重要な転写因子のHIV遺伝子発現に対する制御作用を検証しました。
研究結果データ分析と初期の発見scRNA-seqとscATAC-seqの分析を統合し、約125,000細胞から高品質のクロマチンアクセシビリティとRNAデータを取得しました：
異なる条件下で、次元削減法を用いて、原代CD4+ T細胞と2D10細胞が異なるLRA処理後に顕著な分離を示すことを発見しました。これは各LRAが細胞のトランスクリプトームに異なる影響を与えることを示しています。
HIVの転写の遺伝子発現を検出したところ、LRAのVorinostatとProstratinがウイルスRNAの豊富さを顕著に上昇させる一方、iBET151の効果はわずかでした。これは、これらのLRAがHIV遺伝子の再活性化に異なる効果を持つことを示しています。
重要な調節因子の特定分析を通じて、研究チームはHIV転写に関連する複数の細胞転写因子とクロマチン特性を特定しました：
Jurkat細胞株2D10では、最も顕著に関連する転写因子はGATA3（正の相関）とCTCF（負の相関）でした。
原代CD4+ T細胞では、CENPF（中間フィラメント）、GAPDH（活発な細胞代謝と細胞分裂に関連）、BACH2（転写因子）など、有意に関連する遺伝子が発見されました。さらに、プロウイルスクロマチンのアクセシビリティとウイルス遺伝子発現の関連性が検出され、AP-1やNF-κBファミリーメンバーなど、複数の有意な調節作用を持つ転写因子も発見されました。
機械学習手法を用いて得られたデータを分析した結果、機械学習モデルが細胞内のHIV発現を予測する上で顕著な効果を示すことが明らかになりました。
機能検証HIV reactivationにおけるGATA3の役割:
shRNA技術を用いてGATA3遺伝子発現を抑制した結果、Prostratin刺激後のウイルス遺伝子発現が顕著に減少しました。
HIV reactivationにおけるFOXP1の役割:
FOXP1遺伝子発現の抑制はウイルス遺伝子発現の活性化をもたらしました。逆に、FOXP1の過剰発現はウイルス遺伝子の発現を抑制しました。
原代CD4+ T細胞において、同様にCRISPR/Cas9技術を用いてGATA3とFOXP1遺伝子をノックアウトし、処理後にProstratinで刺激したところ、HIVの発現が顕著な影響を受けることが確認され、GATA3とFOXP1がHIV潜伏逆転において重要な調節役割を果たすことが検証されました。
結論と展望研究結論単一細胞マルチオミクス技術を統合することで、研究チームは潜在的に重要なHIV再活性化の新規調節因子、特に転写因子GATA3とFOXP1を特定しました。これらの発見は、理論レベルでHIV潜伏とその逆転メカニズムの理解を深めただけでなく、HIV治療戦略に新たな潜在的標的を提供しました。
応用価値これらのデータは、単一細胞解像度のマルチオミクスアプローチがHIV遺伝子発現制御の複雑なネットワークを効果的に解明できることを示しており、より効果的なLRA戦略の開発およびHIV潜伏プールの完全な除去に重要な科学的根拠を提供しています。
研究のハイライト革新的なマルチオミクス分析手法：scRNA-seqとscATAC-seqを総合的に利用し、単一細胞の遺伝子発現とクロマチンアクセシビリティを同時に捉え、包括的なマルチオミクスの視点を提供しました。
機械学習支援分析：機械学習技術を活用し、高次元データから重要な特徴を抽出し、HIV潜伏逆転メカニズムの予測精度を向上させました。
重要な転写因子の役割の成功的な検証：機能的検証を通じて、GATA3とFOXP1がHIV潜伏逆転において重要な役割を果たすことをさらに確認しました。
研究の意義この研究はHIV潜伏メカニズムの探索に新たな研究パラダイムを提供し、同時により広範で効果的なLRA戦略の開発に向けて重要な一歩を踏み出しました。将来的に、より多くのHIV再活性化調節因子の詳細な分析と機能検証を進めることで、HIVの根絶により多くの可能性をもたらすことが期待されます。