ヒト3D線条体-黒質アッセンブロイドの構築によるハンチントン病における中型棘状ニューロン投射欠陥の再現
人間3D線条体-黒質体神経様オルガノイドを構築してハンチントン病における中型棘状神経細胞の投射欠損をシミュレートする
背景紹介
ハンチントン病（HD）は、運動系の顕著な衰退を引き起こす神経変性疾患であり、主な特徴は線条体（striatum）から中脳黒質（substantia nigra，SN）への中型多棘神経細胞（medium spiny neurons，MSNs）の投射欠損です。しかし、ハンチントン病の病理生理学を研究する際の課題の一つは、これらの神経回路の欠陥をシミュレートできる効果的なヒトモデルが欠如していることです。ハンチントン病の原因はハンチントン遺伝子（huntingtin gene）の異常なCAGリピートの拡張によるものとされていますが、有効な治療法がまだ不足しているため、薬理学研究に使用できるモデルが欠如していることが一因と考えられます。
ハンチントン病患者において、線条体-黒質（striatum-substantia nigra，STR-SN）回路の機能障害は一連の運動関連症状を引き起こします。近年、人間多能性幹細胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）から分化したヒト脳オルガノイド（organoids）は、人間の脳の発達および脳疾患の病理生成を研究するための有望な実験モデルとされています。しかし、領域特異的な脳オルガノイドの技術を利用する中で一部成功を収めているものの、STR-SN微小回路をシミュレートするオルガノイドアセンブロイド（assembloids）はいまだ完全には確立されていません。
出典および著者情報
本稿はShanshan Wu、Yuan Hong、Chu Chu、Yixia Gan、Xinrui Li、Mengdan Tao、Da Wang、Hao Hu、Zhilong Zheng、Qian Zhu、Xiao Han、Wanying Zhu、Min Xu、Yi Dong、Yan LiuおよびXing Guoによって執筆され、2024年5月21日のProceedings of the National Academy of Sciences（PNAS，doi: 10.1073/pnas.2316176121）に掲載されました。記事に利益相反はなく、PNAS Direct Submission上に公開されています。関連する記事の編集者はJohns Hopkins University School of MedicineのTed M. Dawsonです。
研究方法
研究フロー
ヒト線条体オルガノイドの生成：まず、以前の報告に基づいてhPSCsから機能性MSNsを分化させます。研究者は分化スキームを修正および最適化し、神経上皮細胞をSonic Hedgehog（SHH）で早期に処理することで、線条体投射神経細胞を含む外側膝状突起前駆細胞（LGE）に分化させました。
3D STR-SN結合オルガノイドの構築：線条体オルガノイドをSNオルガノイドと融合させることで、三次元（3D）STR-SNオルガノイドアセンブロイドを生成しました。研究者はAAV-HSyn-GFPを介してウイルス標識を行い、線条体オルガノイドからのMSNsがSNオルガノイドに対して広範に投射し、SNオルガノイドのGABA作動性神経細胞とシナプス接続を形成することを観察しました。
HD患者由来のiPSCsオルガノイドの生成と融合：さらに、ハンチントン病患者由来の誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）オルガノイドを生成し、HDのSTR-SNオルガノイドアセンブロイドを構築しました。
具体的な実験手順
線条体オルガノイドの分化：異なる濃度のSHHで処理し、D30とD60でLGE前駆マーカーNKX2.1およびGABA作動性神経細胞マーカーGAD67の発現を確認しました。
RNAシーケンシング（scRNA-Seq）：D30とD60の線条体オルガノイドに対してscRNA-Seqを実施し、これらのオルガノイドの領域特異性を検証しました。
融合オルガノイドの生成と検証：GFPで標識された線条体オルガノイドとSNオルガノイドを融合させ、STR-SNアセンブロイドを生成し、免疫蛍光および電子顕微鏡を用いてシナプス接続を検証しました。
カルシウムイメージングと電気生理学的検出：カルシウムイメージングおよびオプトジェネティクス技術を使用して、オルガノイド内の神経細胞の機能的シナプス接続を検出しました。
研究結果
線条体オルガノイドの生成
D30とD60の期間において、これらのオルガノイドは線条体領域の特有の遺伝子発現パターンおよび機能性フィブロブラスト様電流を示しました（図1C-E）。
RNAシーケンシングの結果、オルガノイド内のMSNsはヒト胎児脳の線条体に類似した転写プロフィールを持っていることが確認されました。電気生理学的記録では、これらの細胞は典型的な速い、失活する内向きおよび外向き電流および自発的なリズミカルな発火を示しました。
3D STR-SNアセンブロイドの構築と機能検証
- オプトジェネティクスおよび全細胞パッチクランプ記録を通じて、アセンブロイド内のMSNsがGABA作動性神経細胞およびドパミン作動性神経細胞と機能的なシナプス接続を形成していることが確認されました。融合オルガノイドのカルシウム活性が著しく増強され、単独の線条体オルガノイドと比較して、より高い機能的成熟度を示しました。
HD患者由来オルガノイドとアセンブロイド
三種のHD患者由来iPSCs線条体オルガノイドを生成し、顕著なmHTT凝集特徴（図2B-E）およびこれらのオルガノイド内のMSNs数の顕著な減少を観察しました。D30時点で、HDオルガノイド内の細胞増殖能力が顕著に低下し、アポトーシス細胞の割合が著しく増加しました。
HDオルガノイドアセンブロイドのカルシウム信号が著しく低下し、オプトジェネティクス記録および電気生理学的検出では、これらのアセンブロイドの神経活動が顕著に低下し、HD患者の神経細胞接続および機能に明らかな欠陥があることを示しました（図3A-F，4A-C）。
薬物治療研究
- 脳由来神経栄養因子（BDNF）がHDオルガノイドにおける治療効果を持つかどうかを探求し、その結果、BDNFがHDオルガノイド内のMSNs数および機能を顕著に改善し、神経細胞投射およびカルシウム信号が対照レベルに近い状態に回復することが示されました（図4G-K）。
研究結論と意義
人間STR-SNアセンブロイドを構築することで、本研究はハンチントン病におけるSTR-SN回路欠陥を研究するためのヒト由来のin vitroプラットフォームを提供します。このプラットフォームは他の神経変性疾患にも参考価値と指針を提供し、潜在的な薬物試験への応用可能性を示しています。今後の研究では、このプラットフォームを利用して様々な精神疾患の発展と神経接続性を探求し、関連する治療戦略の研究を推進することが期待されます。
研究ハイライト
革新性：ヒト由来のSTR-SNアセンブロイドを初めて構築し、in vivoの神経回路欠陥を成功裏にシミュレート。
多様性：異なる由来のiPSCsを含むことで、様々な病理研究に広範な応用可能性を提供。
薬物試験：BDNFによるHD治療の信頼性と有効性を実証し、薬物試験での応用性を提示。
他の価値ある情報
本研究は中国の複数の研究助成プロジェクトによって支援されており、国家重点研究開発計画および国家自然科学基金などが含まれます。さらに、すべての原始および処理された単一細胞RNAシーケンシングデータはGene Expression Omnibus（GEO）データベースに保存されており、研究データは公開され、他の研究者が参考に利用できるようになっています。この研究を通じて、研究チームはHDおよび他の神経変性疾患の研究に強力なツールとプラットフォームを提供し、これらの疾患の発病メカニズムのさらなる理解と新しい治療法の開発および実施に寄与することが期待されます。