脊椎動物の体幹発生における体外モデル研究

学術的背景

脊椎動物の体幹発生は、複数の細胞タイプの生成と組織化を伴う高度に調和されたプロセスである。このプロセスの中心には、胚の後部に位置する前駆細胞群があり、複雑なシグナルネットワークを介して神経管、体節、脊索（notochord）などの組織に分化する。脊索は脊索動物の特徴的な構造であり、胚発生において機械的支持を提供するだけでなく、シグナル分子を分泌して周囲の組織の発生を調節する。しかし、既存の体外モデル、例えば多能性幹細胞（pluripotent stem cells, PSCs）を用いた分化モデルは、体幹発生の一部を再現できるものの、脊索やその依存組織（例えば神経管の底板（floor plate））を欠いていることが多い。これにより、脊椎動物の体幹発生メカニズムの研究におけるこれらのモデルの応用が制限されている。

この空白を埋めるため、The Francis Crick Instituteの研究チームは、単一細胞トランスクリプトーム解析を用いてニワトリ胚の体幹発生の分子地図を作成し、これに基づいてヒト多能性幹細胞を脊索を持つ三次元体幹構造に分化させる新しい体外モデルを開発した。この研究は、脊椎動物の脊索形成のメカニズムを明らかにするだけでなく、生理学的に関連する環境での組織パターン形成の研究のための新しいツールを提供するものである。

研究チームと発表情報

この研究は、Tiago Rito、Ashley R. G. Libby、Madeleine Demuth、Marie-Charlotte Domart、Jake Cornwall-Scoones、およびJames Briscoeによって行われ、研究チームはThe Francis Crick Institute（ロンドン、英国）に所属している。研究論文は2024年11月1日に『Nature』誌にオンライン掲載され、タイトルは「Timely TGFβ signalling inhibition induces notochord」である。

研究の流れと実験設計

1. 単一細胞トランスクリプトーム解析

研究チームはまず、ニワトリ胚の尾部領域の単一細胞トランスクリプトーム解析を行い、4、7、10、および13体節段階の胚（Hamburger-Hamilton stages 8–11）をカバーした。Louvainクラスタリングとマーカー遺伝子の発現解析を通じて、原始線条（primitive streak）、初期中胚葉（mesoderm）、体節前中胚葉（presomitic mesoderm）、側板中胚葉（lateral plate mesoderm）、および脊索細胞を含む複数の細胞タイプを定義した。脊索細胞は、TBXT、NOTO、SHH、CHRDなどの特定のマーカー遺伝子を発現していた。

2. 体外モデルの構築

ニワトリ胚のトランスクリプトームデータに基づき、研究チームはヒト胚性幹細胞（human embryonic stem cells, hESCs）を用いて体幹発生を模倣する体外モデルを開発した。研究者らはまず、単層培養においてWntおよびFGFシグナル経路を活性化し、BMPおよびNodalシグナルを抑制することで、SOX2+TBXT+の神経中胚葉前駆細胞（neuromesodermal progenitors, NMPs）の誘導に成功した。その後、研究者らはマイクロパターン化されたラミニン基板上でhESCsを培養し、幾何学的な制約下で細胞が秩序だった遺伝子発現パターンを形成することを観察した。中心領域はSOX2高発現の神経前駆細胞であり、辺縁領域はTBXT高発現の中胚葉細胞であった。

3. シグナル経路の制御

細胞運命決定におけるシグナル経路の役割をさらに解明するため、研究チームはYAP、ERK1/2、およびWntシグナルがニューロイド（neuruloids）の発生中にどのように動的に変化するかを分析した。その結果、YAPの不活性化がWntシグナルの活性化とTBXTの発現を促進し、持続的なMAPK経路の活性が辺縁領域でのTBXT発現を維持することが明らかになった。さらに、BMPおよびNodalシグナルの抑制タイミングが脊索細胞の形成に重要な役割を果たすことも発見された。BMPおよびNodalシグナルの抑制を遅らせることで、TBXT+FOXA2+の脊索様細胞の割合が著しく増加した。

4. 三次元体幹オルガノイドの生成

上記の知見に基づき、研究チームはシグナル制御条件を三次元培養に適用し、脊索を持つ体幹オルガノイド（notoroids）の生成に成功した。これらのオルガノイドは培養過程中に徐々に伸長し、内部にTBXT+の脊索様構造を形成し、外層はSOX2+の神経上皮細胞であった。単一細胞RNAシーケンシングを通じて、研究者らはオルガノイド内に存在する細胞タイプ（脊索細胞、体節中胚葉、神経前駆細胞など）をさらに検証した。

主な研究結果

1. 単一細胞トランスクリプトーム解析：研究チームはニワトリ胚の体幹発生の分子地図を作成し、特に脊索前駆細胞の転写特性を含む複数の前駆細胞群とその空間分布を定義した。

2. 体外モデルの構築：Wnt、FGF、BMP、およびNodalシグナルを制御することで、研究者らはヒト多能性幹細胞を脊索を持つ三次元体幹構造に分化させることに成功した。

3. シグナル経路の制御：YAPの不活性化と持続的なMAPK経路の活性がTBXT発現と脊索細胞形成の鍵となる要因であることが明らかになった。さらに、BMPおよびNodalシグナルの抑制タイミングが脊索細胞の割合に大きな影響を与えることも発見された。

4. 三次元体幹オルガノイドの生成：研究チームは脊索を持つ体幹オルガノイドの生成に成功し、これらのオルガノイドは培養過程中に体内発生と類似した組織構造と遺伝子発現パターンを示した。

結論と意義

この研究は、単一細胞トランスクリプトーム解析と体外モデルの構築を通じて、脊椎動物の脊索形成の分子メカニズムを明らかにし、ヒトの体幹発生の複数の重要なプロセスを模倣する新しい体外モデルの開発に成功した。この研究は、脊椎動物の体幹発生を理解するための新しい知見を提供するだけでなく、生理学的に関連する環境での組織パターン形成と疾患モデルの研究のための重要なツールを提供するものである。

研究のハイライト

1. 脊索形成の分子メカニズム：研究は初めて、YAP、Wnt、およびFGFシグナルが脊索形成において協調的に作用し、特にYAPの不活性化がTBXT発現を促進することを明らかにした。

2. 新しい体外モデルの開発：研究は脊索を持つ三次元体幹オルガノイドの構築に成功し、既存の体外モデルが脊索およびその依存組織を欠いているという空白を埋めた。

3. シグナル制御の時間窓：研究は、BMPおよびNodalシグナルの抑制タイミングが脊索細胞の形成に重要な影響を与えることを発見し、今後の体外分化条件の最適化に重要な指針を提供した。

その他の価値ある情報

研究チームは、単一細胞RNAシーケンシングとイメージング解析を通じて、三次元体幹オルガノイドの細胞タイプと組織構造を詳細に記述し、モデルの生理学的関連性をさらに検証した。さらに、脊索様細胞がSHHシグナル分子を分泌して周囲の神経組織のパターン形成を調節することが明らかになり、これは体内発生プロセスと高い一致を示している。

総じて、この研究は脊椎動物の体幹発生の研究に新しいツールと知見を提供し、重要な科学的および応用的価値を持つものである。