オレンジ果皮配糖体介入がラット脳虚血再灌流モデルにおける新生ニューロンとBDNFレベルに与える影響に関する研究報告

背景

世界的に心血管疾患が増加するにつれ、虚血性脳卒中は主要な死亡および障害の原因となり、何百万人もの生活の質に影響を与えています。現代医学は血栓溶解薬や機械的血栓回収術など治療法において進歩を続けていますが、患者は発症後短時間のうちに迅速な治療を受ける必要があり、これらの治療の時間枠が非常に狭いため、機能回復が限られ、高度の障害率を伴うことがよくあります。そのため、機能回復を向上させ障害率を低下させる新たな治療法を探索することがますます重要になっています。

脳虚血再灌流障害後の内因性神経新生過程の活性化は、近年研究の焦点となっている分野です。これまでの研究により、虚血性障害がラットの側脳室下帯（SVZ）と歯状回顆粒下層（SGZ）において低レベルの内因性神経新生を引き起こし、その後神経芽細胞が損傷部位に移動することが示されています。そのため、外因性因子によって神経幹/前駆細胞の増殖、移動、およびシナプス統合を刺激し、脳卒中後の運動および認知機能の回復を改善することが広く研究されています。

多くの外因性因子の中で、フラボノイドは天然の化合物として、その抗酸化および抗炎症特性により注目を集めています。特に、オレンジ果皮配糖体（Naringin）はグレープフルーツやオレンジから抽出される天然フラボノイドで、生理的および病理的条件下で神経新生と脳由来神経栄養因子（BDNF）レベルに対して積極的な影響を持つことが証明されています。

出典

この研究はトルコのSelcuk UniversityのEsen Yilmaz、Gozde Acar、Ummugulsum Onal、Ender Erdogan、Abdulkerim Kasim Baltaci、Rasim Mogulkocらの研究者によって実施され、2024年第26巻第4号の「Neuromolecular Medicine」誌に掲載されました。

研究デザインと方法

研究対象

研究には40匹のWistar系雄ラット（10-12週齢）が使用され、すべてSelcuk University実験動物研究応用センターから入手しました。実験の前後を通じて、すべてのラットは標準飼料と水を自由に摂取できました。

実験群分け

実験は5群に分けられました： 1. 対照群（n=6） 2. 偽手術群（n=6） 3. 虚血再灌流群（n=9） 4. 虚血再灌流 + 媒体群（n=9） 5. 虚血再灌流 + オレンジ果皮配糖体群（n=10）

実験手順

両側頸動脈閉塞/再灌流モデルの確立

二血管閉塞モデル（2VO）を使用して、ラットに実験的全脳虚血を引き起こしました。手術手順は以下の通りです： 1. ラットはケタミンとキシラジン（60mg/kgと5mg/kg）の注射で麻酔されました。 2. 麻酔されたラットを背中を上にして手術台に固定し、頸部正中切開を行って左右の総頸動脈を露出させました。 3. 総頸動脈を慎重に分離し、30分間結紮して全脳虚血を誘導しました。 4. 30分後に結紮を解除し、血流の再開を確認後、切開部を閉じました。

偽手術群では総頸動脈の分離のみを行い、閉塞は行いませんでした。

薬物処理

虚血再灌流後、対照群と偽手術群は薬物処理を受けず、虚血再灌流 + 媒体群は媒体CMC-Na（カルボキシメチルセルロースナトリウム、0.25%）で14日間処理され、虚血再灌流 + オレンジ果皮配糖体群はオレンジ果皮配糖体（100mg/kg）の経口投与を14日間受けました。

動物行動学的評価

神経機能スコア

神経機能を評価するため、研究ではBedersonスコアリングシステムを使用してラットの神経機能スコアを測定しました。スコアは0-3点の範囲で、機能障害なし（0点）から最大機能障害（3点）に対応します。

ロータロッドテスト

虚血再灌流モデル確立の4日前から、運動機能を評価するためのロータロッドテストを開始しました。テストは虚血再灌流後の1日目、7日目、14日目に繰り返し行われ、ラットがロータロッド上に留まる時間を記録しました。

分子検出と組織学的分析

組織採取

実験終了後、ラットを安楽死させ、海馬と前頭皮質組織を採取しました。

免疫組織化学分析

40個の海馬サンプルと40個の前頭皮質サンプルに対して免疫組織化学分析を実施しました。DAPIで染色してすべての有核細胞を標識し、抗Neu抗体で成熟ニューロンを標識しました。

リアルタイム定量PCR分析

脳組織から総RNAを抽出し、cDNAに逆転写し、リアルタイム定量PCR分析を通じてDCX（新生ニューロンマーカー）とBDNFの発現レベルを検出しました。

結果

神経機能への影響

虚血再灌流モデルは神経機能スコアを有意に増加させましたが、オレンジ果皮配糖体の補充はスコア値を有意に低下させ、オレンジ果皮配糖体が神経損傷に対して一定の保護作用を持つことを示しました。

運動機能への影響

ロータロッドテストの結果は、虚血再灌流がラットのロータロッド上の滞在時間を有意に減少させたことを示しましたが、2週間のオレンジ果皮配糖体の補充により、それが対照群のレベルに近くまで有意に回復しました。

神経新生とBDNFレベル

免疫組織化学の結果は以下を示しました： 1. 虚血再灌流は海馬と前頭皮質におけるDAPIとNeuNマーカーのレベルを有意に低下させました。 2. オレンジ果皮配糖体の補充はこれらのマーカーの発現レベルを有意に回復させました。

リアルタイム定量PCRの結果は以下を示しました： 1. DCXとBDNF遺伝子の発現レベルは虚血再灌流群で有意に低下しました。 2. オレンジ果皮配糖体の補充はこれら2つの遺伝子の発現レベルを有意に回復させました。

結論と意義

研究は、30分間の全脳虚血と2週間の再灌流がラットの神経および運動機能障害を引き起こすことを示し、オレンジ果皮配糖体の補充がこれらの障害を有意に改善できることを示しました。具体的には、神経新生マーカーDCXとNeuNの発現を増加させ、抑制されたBDNFレベルを回復させることで、ラットの神経および運動機能を向上させました。これはオレンジ果皮配糖体が虚血性脳障害の潜在的治療薬候補として基礎を提供しています。

将来の研究方向

オレンジ果皮配糖体が神経栄養因子受容体（TrkBなど）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK/ERK）、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）などのシグナル経路を通じて作用するメカニズムをさらに研究し、神経保護と神経新生における分子メカニズムをより詳細に解析することが、より効果的な脳卒中治療法の開発に役立つでしょう。