胶质瘤免疫治疗中的三级淋巴结构诱导及其抗肿瘤免疫作用

背景介绍

胶质瘤（glioma）是一种高度恶性的脑肿瘤，其特点是肿瘤微环境（glioma microenvironment, GME）中淋巴细胞浸润有限，呈现出“免疫荒漠”状态。这种特性使得胶质瘤对多种免疫疗法不敏感，导致治疗效果不佳。近年来，免疫治疗在多种实体瘤中取得了显著进展，但在胶质瘤中的应用仍然面临巨大挑战。尽管针对胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）的免疫治疗研究已经展开，但仅有不到20%的患者能够从中获得持久的临床益处。因此，如何通过新的免疫治疗策略促进肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TILs）在GME中的浸润，并将GME从免疫抵抗状态转变为免疫激活状态，成为了当前研究的重点。

三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures, TLS）是一种在肿瘤微环境中形成的类似次级淋巴器官的结构，能够促进局部免疫反应。TLS的存在与多种癌症的预后改善相关，尤其是在免疫“冷”肿瘤中诱导TLS的形成被认为是一种有潜力的治疗策略。然而，TLS在胶质瘤微环境中的作用及其诱导机制尚不明确。因此，本研究旨在探索通过Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）激动剂诱导TLS形成，进而增强抗胶质瘤免疫反应的策略。

论文来源

本论文由Shaoping Shen、Yong Cui、Mingxiao Li等多位作者共同完成，主要作者来自北京天坛医院神经外科、首都医科大学等机构。论文于2024年8月27日提前发表在Neuro-Oncology期刊上，题为《Toll-like receptor agonists promote the formation of tertiary lymphoid structure and improve anti-glioma immunity》。

研究流程与结果

1. 研究设计与实验流程

本研究通过颅内注射TLR激动剂（OK-432）和胶质瘤抗原（i.c. αTLR-mix）诱导GME中TLS的形成，并探讨其抗胶质瘤免疫的机制。研究分为以下几个主要步骤：

a) 胶质瘤小鼠模型的建立与治疗

• 研究对象：使用C57BL/6小鼠，分别接种GL261和CT-2A胶质瘤细胞，建立颅内胶质瘤模型。
• 治疗方法：将TLR激动剂和胶质瘤抗原混合后，通过颅内注射（i.c.）给予治疗组小鼠，对照组则注射PBS。
• 实验设计：治疗组和对照组小鼠分别在治疗后的第7、14、21天进行MRI扫描，评估肿瘤生长情况，并在第21天收集脑组织样本进行后续分析。

b) TLS形成的检测与分析

• 染色分析：通过HE染色、免疫组化（IHC）和多重荧光免疫组化（mIHC）检测TLS的形成及其细胞组成。
• 流式细胞术：分析脑组织中B细胞（B220+）、T细胞（CD3+ CD4+和CD3+ CD8+）的浸润情况。
• 单细胞RNA测序（scRNA-seq）：对脑组织和颈淋巴结（cervical lymph node, CLN）样本进行单细胞RNA测序，分析B细胞和T细胞的状态及其分化轨迹。

c) TLS诱导机制的探索

• 抗体中和实验：通过注射TNF-α和LTβR的阻断抗体，评估这些信号通路在TLS形成中的作用。
• 细胞间相互作用分析：利用CellPhoneDB软件分析单细胞RNA测序数据，识别TLS诱导过程中关键的细胞间相互作用。

d) 临床前研究

• 临床试验：在一项名为“Combined Stereotactic Radiosurgery and Enhanced Immunotherapy for rGBM”的临床试验中，评估i.c. αTLR-mix治疗的安全性和初步疗效。

2. 主要研究结果

a) TLS的形成与淋巴细胞浸润

• TLS的形成：在治疗组小鼠的GME中成功诱导了TLS的形成，TLS主要由CD19+ B细胞、CD3+ CD4+/CD8+ T细胞和CD11b+髓系细胞组成。
• 淋巴细胞浸润增加：治疗组小鼠的GME中B细胞和T细胞的浸润显著增加，尤其是CD4+ T细胞的浸润明显增多。

b) TLS诱导的机制

• LTα/β-LTβR信号通路的作用：通过抗体中和实验发现，LTα/β-LTβR信号通路在TLS诱导中起关键作用。阻断该信号通路会显著抑制TLS的形成，并加速肿瘤生长。
• TH17细胞的作用：单细胞RNA测序数据显示，CD4+ TH17细胞在TLS诱导中发挥了“淋巴组织诱导细胞”（lymphoid tissue inducer, LTI）的作用。

c) TLS在抗胶质瘤免疫中的作用

• CD4+ T细胞的关键作用：抗体中和实验表明，CD4+ T细胞在TLS形成和抗胶质瘤免疫中起关键作用，而CD8+ T细胞也对抗肿瘤免疫有贡献，但B细胞的作用不明显。
• B细胞的分化与克隆选择：单细胞RNA测序和BCR测序分析显示，脑组织中的B细胞经历了从初始状态到成熟状态的转变，并表现出克隆选择和类别转换重组（class switch recombination, CSR）的特征。

d) 临床前研究结果

• 临床试验的初步结果：在临床试验中，i.c. αTLR-mix治疗显示出良好的耐受性，部分患者的肿瘤体积缩小，且治疗组的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）显著延长。

3. 研究结论与意义

本研究表明，通过TLR激动剂诱导GME中TLS的形成，能够显著增强抗胶质瘤免疫反应，改善免疫微环境，并控制肿瘤生长。TLS在GME中可能作为抗原呈递的场所，促进局部免疫反应的激活。这一发现为胶质瘤的免疫治疗提供了新的思路和实验基础。

4. 研究亮点

• TLS诱导的新策略：本研究首次通过TLR激动剂成功诱导了GME中TLS的形成，并揭示了其抗肿瘤免疫的机制。
• TH17细胞的关键作用：研究发现TH17细胞在TLS诱导中发挥了“淋巴组织诱导细胞”的作用，这一发现为理解TLS的形成机制提供了新的视角。
• 临床转化的潜力：临床试验的初步结果表明，i.c. αTLR-mix治疗在胶质瘤患者中具有潜在的应用价值。

总结

本研究通过系统的实验设计和深入的数据分析，揭示了TLS在胶质瘤免疫治疗中的重要作用，并为未来的临床转化提供了有力的实验依据。这一研究不仅为胶质瘤的免疫治疗开辟了新的方向，也为其他免疫“冷”肿瘤的治疗提供了借鉴。