内源性大麻素通过细胞外微泡按需释放

学术背景

内源性大麻素（endocannabinoids, ECBs）是一类脂质神经递质，通过激活大麻素受体CB1在大脑功能中发挥关键作用。与经典的神经递质不同，ECBs的储存和释放机制一直未能被完全阐明，这导致了对这些信号如何调控的理解存在重大空白。尤其是2-花生四烯酸甘油（2-arachidonoylglycerol, 2-AG）作为主要的ECB之一，其释放和运输的分子机制尚不明确。此前的研究提出了“按需生产”（on-demand production）模型，认为2-AG在特定刺激下由神经元合成并释放，但这一模型无法完全解释2-AG如何从神经元中释放以及如何跨越细胞膜到达靶细胞。

为了解决这一问题，研究人员开发了一个结合遗传编码荧光传感器、电生理学和数学模型的实验系统，以高时间精度研究内源性大麻素信号传导。他们的发现提出了一种新的“按需释放”（on-demand release）模型，认为微泡（microvesicles）的形成是2-AG释放的关键步骤。这一模型不仅扩展了“按需生产”模型，还调和了此前提出的三种ECB运输假说，为理解内源性大麻素信号传导提供了新的框架。

论文来源

这篇论文由Verena M. Straub、Benjamin Barti、Sebastian T. Tandar等作者共同撰写，来自Leiden University、Indiana University、Peking University等多个研究机构。论文于2025年2月20日发表在PNAS（Proceedings of the National Academy of Sciences）期刊上，题目为《The endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol is released and transported on demand via extracellular microvesicles》。

研究流程

1. 实验系统开发

研究人员开发了一种基于荧光传感器GRABECB2.0的双培养系统，用于研究2-AG的释放和运输。该系统由表达GRABECB2.0的HEK293T细胞和神经元细胞（Neuro2A）组成。当Neuro2A细胞受到刺激时，释放的2-AG会激活邻近HEK293T细胞上的GRABECB2.0传感器，从而通过荧光信号的变化实时监测2-AG的动态变化。

2. 荧光传感器验证

通过共聚焦显微镜和荧光板读数器，研究人员验证了GRABECB2.0传感器在检测2-AG释放中的有效性。实验表明，当Neuro2A细胞受到ATP刺激时，HEK293T细胞的荧光信号显著增强，而突变型GRABECB2.0传感器则无反应。此外，通过添加不同的抑制剂，研究人员进一步确认了2-AG的释放依赖于蛋白激酶C（PKC）、二酰基甘油脂肪酶（DAGL）和ADP核糖基化因子6（ARF6）的调控。

3. 微泡的分离与表征

研究人员从Neuro2A细胞培养上清中分离了细胞外微泡（extracellular vesicles, EVs），并通过纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）和蛋白质组学对其进行了表征。实验表明，ATP刺激显著增加了EVs的释放量，且这些EVs中含有2-AG，但不含另一种ECB——花生四烯乙醇胺（anandamide）。每个微泡中大约含有2000个2-AG分子。

4. 电生理实验

为了验证微泡在神经元信号传导中的作用，研究人员在急性海马切片中进行了电生理实验。结果表明，ARF6和ECB运输抑制剂能够显著影响2-AG介导的突触可塑性，进一步支持了微泡在2-AG信号传导中的重要性。

5. 数学模型构建

为了定量描述2-AG释放的动力学过程，研究人员构建了一个数学模型。该模型考虑了2-AG的生产、代谢、分布以及微泡的形成和释放。模型拟合结果表明，微泡的形成是2-AG释放的限速步骤，而非2-AG的生产。

主要结果

1. GRABECB2.0传感器的有效性：实验证实了GRABECB2.0传感器能够实时监测2-AG的释放和运输，且信号变化与ATP刺激显著相关。
2. 微泡的释放与2-AG含量：ATP刺激显著增加了EVs的释放量，且这些EVs中含有2-AG，但不含anandamide。每个微泡中大约含有2000个2-AG分子。
3. ARF6和ECB运输抑制剂的作用：ARF6和ECB运输抑制剂能够显著影响2-AG介导的突触可塑性，表明微泡在2-AG信号传导中起到关键作用。
4. 数学模型的支持：数学模型表明，微泡的形成是2-AG释放的限速步骤，而2-AG的吸收是传感器激活的总体限速步骤。

结论

这项研究提出了一种新的“按需释放”模型，认为微泡的形成和释放是2-AG信号传导的关键步骤。这一模型不仅扩展了“按需生产”模型，还为理解内源性大麻素信号传导提供了新的分子机制框架。研究结果表明，携带2-AG的微泡在神经元通信中发挥了重要作用，与经典的突触小泡共同调控神经传递。

研究亮点

1. 新模型的提出：研究首次提出“按需释放”模型，为理解内源性大麻素信号传导提供了新的视角。
2. 实验系统的创新：结合遗传编码荧光传感器、电生理学和数学模型，研究人员开发了一种高时间精度的实验系统，能够实时监测2-AG的动态变化。
3. 微泡的作用：研究发现微泡是2-AG释放的重要载体，每个微泡中大约含有2000个2-AG分子。
4. 跨学科研究：研究结合了分子生物学、电生理学和数学建模，展示了跨学科研究在解决复杂生物学问题中的优势。

研究意义与价值

这项研究不仅深化了对内源性大麻素信号传导机制的理解，还为开发针对CB1受体的药物提供了新的思路。此外，研究提出的“按需释放”模型可能对其他脂质信号传导的研究具有借鉴意义。通过揭示微泡在神经元通信中的作用，研究为神经系统疾病的治疗提供了潜在的新靶点。

其他有价值的信息

1. 蛋白质组学分析：研究人员通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）对EVs中的蛋白质进行了分析，发现多种与2-AG释放和运输相关的蛋白质，如ARF6和FABP5。
2. 数学模型的详细参数：模型估计了2-AG在微泡中的分布和释放速率，为进一步研究提供了定量工具。
3. 电生理实验的验证：研究在海马切片中验证了微泡在2-AG信号传导中的作用，表明这一机制在生理条件下同样适用。

这项研究不仅具有重要的科学价值，还为未来的药物开发和神经系统疾病治疗提供了新的方向。