基于构象和激活的BRET传感器对GPCR-G蛋白耦合的差异性响应

2024-07-10 Wed
GPCR-G蛋白偶联的生物传感器差异研究背景介绍G蛋白偶联受体（GPCRs）是跨膜信号转导的重要分子，能够选择性地与由Gα、Gβ和Gγ亚单位组成的异源三聚体G蛋白结合，调控细胞内的多种信号传导过程。研究GPCR的功能选择性对于理解其生物学功能和开发新药具有重要意义。然而，GPCR与G蛋白的选择性偶联并不总是简单明了，不同的配体可以引导受体偏向不同的Gα蛋白家族亚型。为了研究这一复杂性，生物发光共振能量转移（BRET）技术被广泛应用于开发多种生物传感器，用于监测GPCR-G蛋白的相互作用。然而，不同类型的BRET生物传感器可能对偶联事件的报告存在差异。
研究来源这项研究由Shane C. Wright等人完成，论文于2024年6月18日发表于《Science Signaling》。作者分别来自Université de Montréal, Karolinska Institutet, University of the Basque Country等多家研究机构。研究团队通过比较基于构象变化和激活状态的BRET生物传感器，探讨了它们在报告GPCR-G蛋白偶联过程中的差异。
研究流程1. 研究方法和对象本研究主要比较了两种类型的BRET生物传感器：基于构象变化的Gαβγ传感器和基于激活状态的GEMTA传感器。研究对象包括多种GPCRs，例如5-HT2A和5-HT7受体，GLP-1受体（GLP-1R）以及M3毒蕈碱受体。这些受体在培养的细胞中表达，使用不同的BRET传感器监测其与特定Gα蛋白的偶联。
2. 实验设计Gαβγ传感器：通过共表达带有Renilla luciferase（Rluc）的Gα亚单位、未标记的Gβ亚单位和带有绿色荧光蛋白（GFP）的Gγ亚单位，监测G蛋白三聚体的构象变化。激动剂加入后，受体激活导致Gγ和Gβ亚单位从Gα-Rluc解离，BRET信号下降。
GEMTA传感器：使用工程化的G蛋白效应蛋白（如Rap1GAP1a和P63RhoGEF）结合Rluc和膜锚定的RGFP，监测受体激活后Gα亚单位的活化状态，表现为BRET信号增加。
3. 数据分析通过比较不同BRET传感器在检测GPCR-G蛋白偶联时的响应，评估了传感器选择、受体构建和Gβγ亚单位选择对实验结果的影响。
主要结果1. 传感器选择影响GPCR-G蛋白偶联的确定Gαβγ传感器在检测5-HT7受体偶联Gα蛋白时显示出选择性偶联Gαs的结果，而GEMTA传感器检测到更广泛的Gαi/o和Gαq/11的激活，表明GEMTA传感器具有更高的灵敏度和鲁棒性。
使用突变的Gαi1亚单位进一步验证了GEMTA传感器的检测能力，确认其可以识别活化的Gαi/o家族成员。
2. 受体修饰影响偶联谱的确定研究发现N末端带有3×HA标签的5-HT2A受体与Gαi/o家族成员的偶联能力较弱，而未标记的5-HT2A受体可以激活所有Gαi/o家族成员。这提示受体构建的选择在实验设计中应予以考虑，非修饰受体应被优先使用。
3. Gβγ亚单位选择影响Gα亚单位的活化通过比较不同Gβγ对的选择，发现不同组合的Gβγ亚单位对Gαq的响应有显著影响。例如，GLP-1R在与Gαq偶联时，Gβ2γ8组合产生最高的响应，而不是通常认为的Gβ3γ9组合。
结论与意义本研究表明，不同类型的BRET生物传感器在报告GPCR-G蛋白偶联事件时可能产生差异。GEMTA传感器因其保持蛋白质的天然结构，并具有较高的信噪比，能够检测到更广泛的G蛋白活化事件，而Gαβγ传感器在检测较弱的偶联事件时可能存在局限。此外，受体修饰和Gβγ亚单位的选择也对实验结果有显著影响。
本研究强调了在设计实验时需要谨慎选择生物传感器，并在可能的情况下使用非修饰的受体和G蛋白组合。了解这些差异对于将体外观察结果转化为生理相关的结论具有重要意义。未来的研究应结合多种平台，验证GPCR-G蛋白偶联的生理学意义。
研究亮点传感器选择的重要性：不同类型的BRET生物传感器在检测GPCR-G蛋白偶联时表现出不同的灵敏度和选择性。
受体修饰的影响：标签修饰的受体可能会影响其偶联谱，非修饰受体应被优先使用。
Gβγ亚单位选择的作用：特定Gβγ对的选择对G蛋白的活化具有显著影响，不同受体可能需要不同的Gβγ组合。
其他有价值的信息研究团队建议在未来的研究中，应综合使用多种类型的BRET生物传感器，以全面理解GPCR-G蛋白偶联的复杂性。同时，需进一步验证这些在体外实验中观察到的偶联事件在生理条件下的相关性，以推动药物发现和开发进程。