炎症小体激活介导缺血条件下星形胶质细胞的凋亡和焦亡
炎症小体激活在缺血条件下调节星形胶质细胞的凋亡和焦亡
引言
缺血性中风是导致大脑损伤的主要机制之一，其特征是局部大脑区域因为血流中断而缺氧和缺乏能量。近年来，研究发现炎症反应在缺血性中风中发挥了关键作用。炎症小体（inflammasome）是细胞内多聚蛋白复合物，主要通过激活促炎性半胱氨酸蛋白酶（caspase）并促进促炎性细胞因子如IL-1β和IL-18的成熟和分泌，来驱动炎症反应。目前，大量研究已经确定了炎症小体在缺血性中风引起的神经细胞死亡以及小胶质细胞激活和细胞死亡中的作用，但在星形胶质细胞中的调控机制仍然知之甚少。
研究背景与动机
在中枢神经系统（CNS）中，星形胶质细胞是最丰富的胶质细胞类型，主要分为纤维性星形胶质细胞和原浆性星形胶质细胞。纤维性星形胶质细胞主要位于脑和脊髓的白质中，负责调节轴索周围的细胞外环境；而原浆性星形胶质细胞主要位于灰质中，为神经元提供代谢支持。在缺氧缺血等病理条件下，星形胶质细胞的激活、功能异常和死亡，加速了传导受损和梗死核心区的扩大。反应性星形胶质细胞增生（astrogliosis）是星形胶质细胞对缺血性损害的典型反应，其表现为形态和功能的变化以及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和炎症标志物的表达增加。但缺乏对在缺血条件下炎症小体在星形胶质细胞中的表达和激活的研究。
本文由Lap Jack Wong等人组成的多单位研究团队撰写，包括来自新加坡国立大学、La Trobe大学和成均馆大学的科学家。该论文于2023年8月30日在线发表于《Neuromolecular Medicine》期刊。
研究方法
研究对象和实验设计
研究团队选用了来自小鼠的原浆性星形胶质细胞系（C8-D30）和纤维性星形胶质细胞系（C8-D1a）。这些细胞分别培养在特定的培养基中，当细胞达到80-90%汇合度时，将细胞暴露于缺氧-缺糖（OGD）条件下，模拟缺血环境。
通过重新补充无糖Locke’s缓冲液并把细胞置于95%的氮气和5%的二氧化碳气氛中，随后分别在1小时到24小时的不同时间点进行细胞处理。此外，通过给予不同浓度（1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM）的caspase-1抑制剂，对细胞进行干预，观察其对炎症小体组分和凋亡以及焦亡标志物的影响。
生物化学分析
实验结束后，细胞用PBS洗涤并刮取，以RIPA裂解缓冲液进行蛋白提取，并通过超声波处理以充分均质化细胞裂解液。通过BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白总浓度。同样的方法也用于细胞培养基中的蛋白质沉淀和收集。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析技术，分析炎症小体组分、先导性细胞因子和细胞死亡标志物的表达水平，并使用ImageJ和GraphPad Prism软件进行数据定量和分析。
数据统计
通过单因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni事后检验确定组间显著性差异。实验数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示，统计显著性阈值设定为p < 0.05。
研究结果
炎症小体组分及先导性细胞因子的表达
在缺氧缺糖条件下，原浆性星形胶质细胞中NLRP1、NLRC4和AIM2等模式识别受体（PRRs）的表达水平显著增加。此外，通过时间序列分析发现，缺氧缺糖条件导致原浆性星形胶质细胞中NLRP1、NLRC4和AIM2的表达显著升高，并且NAIP在9小时点呈现上升趋势。
相比之下，纤维性星形胶质细胞在缺氧缺糖条件下NLRP1和NLRC4的表达水平无显著变化，而NAIP的表达则相对减少。适配蛋白ASC和总的caspase-1、-8在时间点上有显著增加，而先导性IL-1β的表达则减少。
炎症小体激活及其促进的星形胶质细胞死亡
在高亮度电化学发光（ECL）的免疫印迹分析对照下，标志着炎症小体激活的裂解型caspase-1、-8和成熟的IL-1β和IL-18在缺氧缺糖条件下均表现出增加的表达，表明了炎症小体的激活。进一步分析结果表明，缺氧缺糖条件下，包括凋亡（cleaved caspase-3）和焦亡（N-terminal gasdermin D）以及次级焦亡（N-terminal gasdermin E ）的细胞死亡标志物的表达也显著增加。
此外，本实验还发现星形胶质细胞在缺氧缺糖条件下可以释放炎症小体组分入培养基中，从而进一步实现细胞外炎症小体的激活来推动炎症反应。
caspase-1抑制对炎症小体激活及星形胶质细胞死亡的影响
通过caspase-1抑制剂的渐进浓度处理，发现其能够有效抑制缺氧缺糖条件下的炎症小体激活和细胞死亡。具体表现为裂解型caspase-1和成熟IL-1β的表达减少，同时凋亡和焦亡标记物的表达也显著降低。
结论
综上所述，本研究确立了炎症小体在缺氧缺糖条件下作为星形胶质细胞炎症反应和细胞死亡的重要调控因子作用。通过对caspase-1的抑制，可以有效减少凋亡和焦亡细胞死亡，提示炎症小体可能成为治疗缺血性中风诱导星形胶质细胞死亡的新靶点。然而，未来有必要通过体内研究进一步验证这些发现，以深入理解炎症小体在大脑缺血条件下星形胶质细胞中的动态作用。本研究为未来相关研究奠定了坚实的基础，与此同时指出了未来研究的重要方向。
研究亮点
- 炎症小体激活在缺血条件下对原浆性和纤维性星形胶质细胞的不同影响：研究首次详细探讨了在缺血条件下炎症小体在不同亚型星形胶质细胞中的表达和激活效果。
- 揭示了炎症小体在细胞外的作用：证明了星形胶质细胞在缺氧缺糖条件下可以通过释放炎症小体组分，进一步推动炎症反应。
- caspase-1抑制剂的有效应用：通过药理学手段对炎症小体的调控，为治疗缺血性中风后的星形胶质细胞死亡提供了新的研究方向和潜在治疗途径。
研究价值
该研究不仅揭示了炎症小体在缺血条件下的角色，还为未来开发抗炎治疗策略提供了重要线索。特别是在星形胶质细胞保护和神经炎症减轻方面，研究结果显示了caspase-1抑制剂的潜在应用价值，为缓解缺血性中风患者的预后提供了新的视角。