56-羧基蛋白末端异构酶(ERP57)对抗ALS相关突变TDP-43在神经细胞中起到保护作用

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ALS 蛋白质二硫键异构酶 ERP57 TDP-43病理 内质网应激

ERP57对ALS相关的突变TD43在神经元细胞中的保护作用研究

引言

肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）是一种严重的神经退行性疾病，影响运动神经元。几乎所有的ALS病例（97%）和大约50%的额颞叶痴呆症（FTD）病例中，都存在一种病理形式的Tar-DNA结合蛋白-43（TDP-43），这表明TDP-43在神经退行性疾病中扮演了重要角色。此前的研究发现，内质网蛋白57（ERP57），一种蛋白二硫键异构酶（Protein Disulphide Isomerase，PDI）家族的成员，在ALS相关的突变超氧化物歧化酶1（SOD1）小鼠模型中起到了保护作用。然而，ERP57是否对ALS中特殊的病理性TDP-43具有保护作用仍不明确。本研究方针是探讨ERP57在TDP-43病理过程中所起的作用，并评估其作为一种潜在治疗靶点的可能性。

研究来源

本文由来自Macquarie University Motor Neuron Disease Research Centre的Sonam Parakh、Emma R. Perri、Marta Vidal以及其他同事合作完成，发表于《Neuromolecular Medicine》。论文于2023年11月16日收到，并于2024年4月9日接受。Julie D. Atkin教授是该研究的主要负责人。

研究流程

研究对象与方法

细胞系：

研究中使用了Mouse neuro-2a神经母细胞瘤细胞系（来源于澳大利亚CellBank），在Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培养基中，配以10%牛胎血清（FCS），在37°C、5% CO_2的环境中培养。

构建与转染：

使用了含有ERP57的pCDNA3.1(+)质粒，由University of Glasgow的Dr Neil Bulleid提供。同时还使用了带有Turbo-GFP标签的TDP-43野生型和突变体TDP-43m337v（来源于pCMV6-AC-GFP）。转染实验使用了Lipofectamine-2000（Invitrogen），根据制造商的协议进行。

免疫细胞化学与显微镜：

神经元细胞采用4%多聚甲醛（PFA）固定，PBS中用0.1% Triton-X渗透。随后使用各种一抗和二抗染色，最后用Hoechst 33342染色核。然后通过荧光显微镜观察细胞并记录数据。

研究主要步骤

1. 问题定义与假设提出：

目标是确定ERP57是否能对ALS相关的突变TDP-43起到保护作用，防止其在神经元细胞中的异常定位和聚集。

2. 细胞系实验：

分别构建了带有TDP-43和ERP57标签的细胞系，通过免疫细胞化学和荧光显微镜观察细胞。主要观察了TDP-43的定位、包涵体形成、ER应激反应以及细胞凋亡。

数据分析与结果

TDP-43稳态水平降低：

研究首先观察了ERP57是否能在神经元细胞中对TDP-43病理起到保护作用。通过共聚焦荧光显微镜对细胞进行72h的转染观察，发现ERP57与TDP-43在99%的转染细胞中共表达。西方印迹显示野生型和突变型TDP-43在存在ERP57时稳态水平下降。在较小的表达水平下，尤其显著（*p < 0.05）。

ERP57防止TDP-43的异常定位：

接下来观察了ERP57与TDP-43m337v共表达时，TDP-43在细胞中的定位情况。实验结果显示，ERP57能显著减少TDP-43在细胞质中的异常定位（*p < 0.05），这表明ERP57可以防止突变TDP-43的错误定位。

ERP57抑制突变TDP-43的包涵体形成：

通过共聚焦荧光显微镜观察细胞定量分析，ERP57共表达能显著减少带有突变TDP-43m337v细胞中的包涵体形成。进一步的3D图像分析显示，ERP57共表达能使包涵体显著减小，表明ERP57在预防TDP-43错误折叠中起到了作用。

ERP57降低ER应激与细胞凋亡：

免疫细胞化学显示ERP57能显著降低由突变TDP-43诱导的ER应激（CHOP免疫反应）和细胞凋亡（碎片化或凝集的核）。

结论与重要发现

本研究主要发现表明：

  1. ERP57能够显著减少突变TDP-43在细胞质中的异常定位，并减少包涵体的形成及其大小。
  2. ERP57能降低由突变TDP-43引起的ER应激和细胞凋亡，显示出其保护作用。
  3. ERP57可能作为一种折叠途径的分子伴侣，帮助维持TDP-43正确的折叠与功能。

本研究首次展示了ERP57在ALS相关TDP-43病理中的保护作用，进一步强调了PDI家族成员在神经退行性疾病中的重要角色。ERP57作为潜在治疗靶点，有望为ALS、FTD等相关神经退行性疾病的治疗提供新的思路。

意义与未来研究方向

本研究为理解ERP57在ALS中的保护机制及潜在治疗应用提供了新的视角。未来研究可进一步探讨ERP57在体内ALS模型中的作用，并确定具体的分子机制与蛋白互作网络。研究也建议考察ERP57在其他神经退行性疾病中的适用性，挖掘其在更广泛临床应用中的潜力。